Parakrin hücreler arasında sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi
Summary
Parakrin ve juxtacrine hücresel etkileşimlerin tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada, proksimal kültür yöntemi parakrin sinyal incelemek için doğrudan hücresel temas engelleyen sırasında salgılanan faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları nerede saklanır kullanılır.
Abstract
Hücreler arası etkileşimler tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Parakrin veya juxtacrine sinyal bu tür etkileşimler aracılık eder. Bir şartına orta ve coculture çalışmalar etkileşimleri bu iki tür arasında ayırımcılık için en yaygın yöntem vardır. Ancak, yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyonda microenvironment salgılanan faktörler parakrin etkileşimleri sırasında etkisini doğru tarafından şartına orta recapitulated değil ve böylece, imprecise sonuçlara yol açabilir. Bu sorunu çözmek için parakrin sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi tasarladılar. İki hücre tipleri 0.4 µm gözenekli bir 10 µm kalınlığında Polikarbonat membran her iki yüzeyi yetiştirilmektedir. Gözenekleri salgılanan faktörler değişimine izin ver ve aynı zamanda, juxtacrine sinyal inhibe. Hücreleri toplanan ve uç noktada parakrin sinyal etkilerini belirlemek için lysed. Salgılanan faktörlerin yerelleştirilmiş konsantrasyon degradeler için izin vermeye ek olarak, bu yöntem takmaktan kültürünün yanı sıra inhibitörleri kullanımını içeren deneyler için mükellef olur. Biz yumurtalık kanseri hücreleri ve metastaz sitesinde karşılaştıkları mesothelial hücreler arasındaki etkileşimler eğitim için bu yöntemi kullanırken, çeşitli alanlarda sinyal parakrin çalışmaya araştırmacılar için herhangi bir iki yapışık hücre tipleri için adapte edilebilir, tümör microenvironment, immünoloji ve geliştirme de dahil olmak üzere.
Introduction
Kanser hücreleri ve tümör microenvironment tümör ilerleme arasındaki üretken karşılıklı etkileşimler rolü de kurulmuş olup araştırma kanser biyoloji1‘ deki önemli bir odak noktası haline gelmiştir. Çift yönlü sinyal benzer örnekleri şifa, bağışıklık yanıtı, anjiogenez, kök hücre nişler, yara ve geliştirme2,3,4,5,6 sırasında açısından büyük önem taşıyor , 7 , 8. hücreleri hücre kaderi, doku fizyolojisi ve hastalık ilerleme belirleyen çeşitli şekillerde ekstraselüler ipuçlarını kendi microenvironment gelen tepki bu biyolojik süreçler içinde ortak bir tema olduğunu. Bu nedenle, odak giderek tür hücre-hücre iletişim içinde yer alan mekanizmaları daha iyi bir anlayış geliştirmek doğru döndü. Bu tür etkileşimler çoğunluğu ücretli olabilecek parakrin veya hücreler arasında sinyal juxtacrine. Parakrin sinyal bir yanıtta ise9,10, tetikleme çevresinde, tabloda başka bir hücreyi tarafından karşılık gelen reseptörleri juxtacrine algılanan spesifik sinyal faktörler bir hücre salgılanmasını içerir sinyal iki hücre dahil11,12hücresel bileşenleri arasında doğrudan temas gerektirir.
Böyle sinyal doku homeostazı, hem de tümör microenvironment çok önemli bir bileşenidir. Kanser hücrelerinin parakrin ve juxtacrine faktörleri kanser ilişkili fibroblastlar (restorantlar), bağışıklık hücreleri ve adiposit13,14,15,16gibi tümör stroma hücreden faydalanın. Juxtacrine sinyal bitişik ligandlar ve çentik sinyal veya integrinler ve onların anılan sıraya göre arasındaki etkileşimler reseptörler içerir iken büyüme faktörleri, sitokinler, kemokinler, vb, aracılı sinyal parakrin hücre dışı matriks proteinleri. Yumurtalık kanseri hücreleri ve restorantlar arasındaki karşılıklı etkileşimler tümör ilerleme ve metastaz14önemini göstermiştir. Benzer şekilde, anahtar mikroRNA ve metastatik kolonizasyon17, teşvik kanser hücreleri transkripsiyon faktörleri Onkolojisti yumurtalık kanser hücrelerinin metastaz sitenin kapsayan mesothelial hücreler ile etkileşimleri düzenleyen 18.
Bir şartına orta ikinci hücre tipi ile tedavi etmek için bir hücre türünden toplanan kullanımı dahil parakrin sinyal üzerinde çoğu çalışmaları. Bu yaklaşım yaygın olarak kullanılan iken, alan hücre microenvironment salgılanan faktöründeki yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyon düzeyleri etkili çoğaltmaz. Aynı zamanda bir hücre tarafından üretilen salgılanan faktörü, sürekli akış kinetik çoğaltmak başarısız olur ve komşu hücre tarafından alınan. Parakrin salgılanan faktörler sadece kaynak hücre çevresinde gerekli konsantrasyonlarda ve diffüz ve mesafe arttıkça dışarı seyreltik eğilimi gibi kısa mesafelerde etkilidir sinyal. Salgılanan faktör bu yerelleştirilmiş yüksek yoğunlukta bir yanıt reseptör hücre olarak tetiklemek için esastır. Ayrıca, alıcı hücrelerdeki yanıt da yeni salgılanan faktörler ve onların sürekli tükenmesi bozulması, bağlama ve içselleştirilmesi alıcı hücreler ve kaynak hücreye uzak difüzyon yoluyla denge bağlıdır. Klimalı orta yüksek yerelleştirilmiş konsantrasyonları microenvironment içinde mevcut için hesabına konsantre olabilir, ama bu doğru bir şekilde tam konsantrasyonları çoğaltma yapamaz. Ayrıca, üretimin doğal kinetik ve faktör ilgili tükenmesi taklit edemez. Daha doğrusu parakrin sinyal çoğaltmak ve mekanizmaları sinyal juxtacrine ayırmak için her iki yüzeyi geçirgen membran iki hücre tipleri büyüyen içerir bir roman proksimal kültür yöntemi tasarladılar. Gözenekleri juxtacrine etkileşimleri önlemek ve henüz yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyonları salgılanan faktörler değişimine izin vermek için küçük. Bu şekilde, bu sistem üretim kinetik ve parakrin faktörler tükenmesi korur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parakrin ve juxtacrine hücreler arasında sinyal mekanizmasının anlama, normal doku homeostazı hastalığı koşullar7,ve8hakkında daha iyi bilgi geliştirmek için önemlidir. Çoğu parakrin toplayarak yürütülen çalışmalar sinyal orta bir hücre tipi ve diğer hücre tipi tedavi etmek için kullanarak şartına. Bu yöntem doğal sadeliği içinde bir avantaja sahiptir. Ancak, bu doğru hücresel microenvironment salgılanan faktörler yerelleştiril…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz hastalara bu deneyler dokusu toplamalarında onların katılım için borçlu bulunmaktadır. Bir DoD OCRP yumurtalık kanseri Akademi Ödülü (W81XWH-15-0253) ve Anirban K. Mitra için Colleen’in rüya Vakfı Ödülü pilot bu araştırma desteklenen.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Recherche en cancérologie. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Recherche en cancérologie. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
