Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Summary

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Abstract

Bestuderen van de regulering van de efferocytosis vereist methoden die kunnen de opname van apoptotic cellen nauwkeurig te kwantificeren en sonde de signalering en cellulaire processen die efferocytosis zijn. Deze kwantificering kunnen moeilijk uit te voeren zoals apoptotic cellen vaak efferocytosed fragmentarisch zijn, aldus dwingt tot methoden die nauwkeurig af te tussen het efferocytosed-gedeelte van een doelwit van de apoptotic versus residuele unengulfed mobiele bakenen kunnen fragmenten. De aanpak hierin maakt gebruik van dual-labeling benaderingen om de dynamiek van efferocytosis en efferocytic capaciteit van efferocytes zoals macrofagen nauwkeurig te kwantificeren. Het cytosol van de apoptotic cel heet met een cel-tracking kleurstof aan controle van alle apoptotic cel-afgeleide materialen, terwijl de oppervlakte biotinylation van de cel van apoptotic zorgt voor differentiatie tussen verinnerlijkte en niet-geïnternaliseerd inschakelen de fracties van de cel van de apoptotic. De capaciteit van de efferocytic van efferocytes wordt bepaald door de fluorescerende opnamen van live of vaste cellen en kwantificeren van het bedrag van de afhankelijke versus verinnerlijkte doelen, zoals onderscheiden door daar kleuring. Deze benadering biedt verschillende voordelen ten opzichte van methoden zoals stroom cytometry, namelijk de nauwkeurige afbakening van niet-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cel breuken, de mogelijkheid voor het meten van efferocytic dynamiek door live-cel microscopie, en de capaciteit voor het uitvoeren van studies van cellulaire signalering in cellen uiten fluorescently-label transgenen. Gecombineerde, dienen de methoden die worden beschreven in dit protocol als basis voor een flexibele experimentele aanpak die kan worden gebruikt om de activiteit van de efferocytic nauwkeurig te kwantificeren en te ondervragen van cellulaire signaalroutes actief tijdens efferocytosis.

Introduction

Apoptosis of geprogrammeerde celdood, is een sterk gereguleerd fysiologische proces dat voorkomt in de meeste meercellige organismen en is van cruciaal belang voor hun ontwikkeling en homeostase¹. Naast betrokkenheid bij normale cel omzet en embryonale ontwikkeling, apoptosis kan de verwijdering van geïnfecteerde of beschadigde cellen van weefsels en kan worden geactiveerd in reactie op de infectie, ontsteking, kanker, en ook door medische ingrepen zoals radiotherapie of steroïden¹. Apoptotic cellen bloot “eten-me” signalen op hun celoppervlak die worden herkend door receptoren op een scala aan professionele en niet-professionele fagocyten, gezamenlijk aangeduid als “efferocytes”. Betrokkenheid van deze receptoren induceert de opname en afbraak van de apoptotic cel door de efferocyte door middel van een proces dat bekend staat als efferocytosis^2,3. Fosfatidylserine is het beste gekarakteriseerd eten-me signaal drijvende efferocytosis. Het is normaliter beperkt tot de innerlijke bijsluiter van het plasma-membraan, met een lipide-scramblase die dit membraan asymmetrie verstoort, dus bloot fosfatidylserine op de oppervlakte van cel⁴activeren apoptosis. Fosfatidylserine is te vinden op het extracellulaire oppervlak van sommige niet-apoptotic cellen, zoals volwassen macrofagen en bloedplaatjes geactiveerd. Deze cellen zijn echter niet efferocytosed als gevolg van de aanwezigheid van “don’t eat me” signalen, zoals CD47, op hun cel oppervlakte^5,6,7. Blootgestelde fosfatidylserine wordt herkend door een matrix van efferocytic receptoren uitgedrukt door efferocytes. Binden van deze receptoren aan fosfatidylserine, activeert ofwel rechtstreeks ofwel via de hulp van opsonins, signaalroutes ter bevordering van de engulfment van de apoptotic cel in een membraan-gebonden vacuole genoemd de efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. de efferosome zekeringen opeenvolgend met Endosomen en lysosomes, die de moleculaire machines nodig breng het efferosome te leveren te degraderen de apoptotic cellen lading^13,14. Zodra gedegradeerd, de apoptotic cel-afgeleide materialen worden verhandeld aan de recycling endosome — een proces die grenzen immuunresponsen aan apoptotic cel-afgeleide antigenen, en die kunnen toestaan voor de terugwinning van voedingsstoffen uit de apoptotic cellen^{13, 15}. Een storing in efferocytosis resulteert in verminderde Goedkeuringvande apoptotic cellen; Deze onontgonnen cellen ondergaan uiteindelijk secundaire necrose. Necrotische cellen introductie pro-inflammatoire cytosolische inhoud, pathogenen en autoantigens in de extracellulaire milieu, dus een drivingrange van besmettelijke, inflammatoire en auto-immune ziekten^16,17. Samen, apoptosis en efferocytosis de opheffing vergemakkelijkt van de stervende en dode cellen en zorgen voor het onderhoud van de weefsel homeostase.

Onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de efferocytosis vereist methoden waarmee een duidelijke kwantificering van apoptotic cellen opname. Deze kwantificering wordt bemoeilijkt door het feit dat in tegenstelling tot andere opname mechanismen zoals endocytose en fagocytose^18,19, efferocytosis niet leiden de engulfment van intact doelcel tot kunnen, resulterend in de versnipperde opname van de apoptotic cel door de efferocyte²⁰. Het protocol hierin beschreven beschrijft een in vitro efferocytosis bepaling waarmee nauwkeurige afbakening van de verinnerlijkte versus niet-geïnternaliseerd gedeelten van individuele apoptotic cellen en kan gecombineerd worden met een aantal vaste-cel en Live-cel microscopie benaderingen. Traditionele fagocytose assays toevoegen antilichamen die specifiek zijn voor de fagocytische doelgroep op het einde van het experiment om het label niet-geïnternaliseerd doelen, waar als onze methode verschilt door etikettering van het doel van de apoptotic met biotine covalent alternerende^{21 , 22}. terwijl apoptotic cel specifieke antilichamen kunnen worden gebruikt in deze test, de biotinylation aanpak zorgt voor geen eiwithoudende doelstelling worden gelabeld en vermijdt potentiële problemen met secundair antilichaam Kruisallergie als immunokleuring wordt uitgevoerd . Specifiek, duidelijk naar voren komt de voorbereiding van apoptotic Jurkat cellen, die dual-gekleurd met zowel een cel bijhouden kleurstof en biotine zijn. De cel voor het bijhouden van kleurstof zorgt voor apoptotic cel-afgeleide materialen worden bijgehouden tijdens de efferocytosis, terwijl de oppervlakte biotinylation zorgt voor de discriminatie van geïnternaliseerd van niet-geïnternaliseerd delen van efferocytosed apoptotic cellen. Ook beschrijven we de cultuur en de voorbereiding van J774.2 en THP-1 cellijnen voor gebruik als lymfkliertest en menselijke efferocytes, monocyt-afgeleide M2 macrofagen als een voorbeeld van de primaire cel efferocytosis en Jurkat cellen voor gebruik als efferocytic doelen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op andere cellijnen of primaire cellen, doelcellen ondergaat elke vorm van celdood (bijvoorbeeld apoptosis, necrose en necroptosis) en micron-sized nabootsers die simuleren van apoptotic cellen via lipide coatings of coating met liganden specifieke aan een receptor efferocytic van belang.

De methode geschetst in dit protocol kent verschillende voordelen ten opzichte van de stroom cytometry gebaseerde methoden gewoonlijk worden gebruikt in het veld^23,24. Door direct imaging de fagocytensysteem-apoptotic cel interactie, gecombineerd met duidelijke etikettering van beide totale en niet-geïnternaliseerd apoptotic cel materiaal, kunnen kwantitatieve metingen van efferocytosis worden gemaakt. Bovendien beperkt het gebruik van pH-ongevoelig fluorophores storende factoren zoals de onderdrukking van FITC en GFP fluorescentie bij lysosomale pH dat kunstdiscours sommige alternatieve methoden²⁵. Tot slot, terwijl niet in detail beschreven, deze methoden kunnen worden ingezet met behulp van uiten van fluorescently-label transgenen, efferocytes of met na fixatie immunokleuring, met het oog op kwantificering van de activiteit van de molecule signalering en monitoring van de cellulaire processen tijdens efferocytosis.

Protocol

Collectie van bloed van gezonde vrijwilligers werd goedgekeurd door de Health Science onderzoek Ethics Board van de University of Western Ontario. Venapunctie werd uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de Tri-Raad-beleidsverklaring inzake menselijke onderzoek. 1. cultuur en voorbereiding van de THP-1 monocyt cellijn Cultuur THP-1 monocyten als een schorsing cultuur in T25 kolven op 37 ° C + 5% CO2. Cellen moeten worden gekweekt in 5 mL Roswell Park Memorial Instit…

Representative Results

‘S nachts cultuur van Jurkat cellen met 1 µM staurosporine resultaten in apoptosis van > 95% van de cellen, die kunnen worden bevestigd met Annexine V kleuring (Figuur 1). Andere celtypes kunnen worden gebruikt voor deze experimenten, hoewel de concentratie van staurosporine en de duur van de behandeling van de staurosporine zal moeten worden geoptimaliseerd voor elke regel van de cel. Voor betrouwbare detectie en kwantificering van efferocytosis, > 80% van …

Discussion

De methoden die worden beschreven in dit protocol inschakelen beeldvorming en kwantificering van het proces van dynamische efferocytic, met behulp van zowel vaste-cel en live-cel benaderingen. Deze benaderingen bieden verscheidene voordelen over algemeen werknemer stroom cytometry gebaseerde methoden^23,24. Het gebruik van binnenstebuiten kleuring met vaste monsters biedt een meer robuuste en nauwkeurige kwantificering van het tarief en de omvang van efferocytosis…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152