Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Summary

Efferocytosis, la suppression phagocytaire des cellules apoptotiques, est nécessaire pour maintenir l’homéostasie et est facilitée par les récepteurs et les voies de signalisation qui permettent la reconnaissance, d’une durée et l’internalisation des cellules apoptotiques. Ici, nous présentons un protocole de microscopie de fluorescence pour la quantification de l’efferocytosis et l’activité des voies de signalisation d’efferocytic.

Abstract

Étudier la régulation de l’efferocytosis exige que les méthodes qui sont en mesure de quantifier avec précision la captation des cellules apoptotiques, d’étudier les processus cellulaires et signalisation contrôlant efferocytosis. Cette quantification peut être difficile à réaliser car les cellules apoptotiques sont souvent efferocytosed fragmentaire, d’où nécessité de méthodes qui peuvent délimiter avec précision entre la partie efferocytosed d’une cible apoptose versus résiduelle cellulaire unengulfed fragments. L’approche décrite ci-après utilise double-marquage des approches afin de quantifier avec précision la dynamique de capacité efferocytosis et efferocytic des efferocytes tels que les macrophages. Le cytosol de la cellule apoptotique est marqué par un agent de la cellule de suivi pour permettre un suivi de toutes les matières de culture cellulaire apoptotique, tandis que biotinylation surface de la cellule apoptotique permet la différenciation entre intériorisée et non-internalisés fractions de cellules apoptotiques. La capacité d’efferocytic d’efferocytes est déterminée en prenant des images fluorescentes des cellules vivantes ou fixes et quantifier la quantité de lié par rapport aux cibles intériorisées, comme dissociés par coloration de streptavidine. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes telles que de la cytométrie en flux, à savoir la délimitation exacte des non-efferocytosed versus efferocytosed fractions de cellules apoptotiques, la capacité de mesurer la dynamique efferocytic par microscopie des cellules vivantes et le capacité d’effectuer des études de signalisation cellulaire dans les cellules exprimant des transgènes fluorescent marqué. Les méthodes décrites dans le présent protocole combiné, servent de base pour une approche expérimentale flexible qui peut être utilisée pour quantifier avec précision l’activité efferocytic et interroger les voies de signalisation cellulaires actives au cours de l’efferocytosis.

Introduction

L’apoptose ou mort cellulaire programmée, est un processus physiologique fortement réglementé qui se produit dans la plupart des organismes pluricellulaires et est essentiel pour leur développement et l’homéostasie du¹. En plus d’être impliqué dans le renouvellement cellulaire normale et le développement embryonnaire, l’apoptose permet l’élimination des cellules infectées ou endommagées, des tissus et peut être déclenchée en réponse à l’infection, inflammation, cancer et aussi par des interventions médicales comme la radiothérapie ou stéroïdes¹. Exposent les cellules apoptotiques « manger-moi » sur leur surface des cellules, des signaux qui sont reconnues par les récepteurs sur un éventail de phagocytes professionnels et non professionnels, appelés « efferocytes ». L’engagement de ces récepteurs induit la captation et la dégradation de la cellule apoptotique de l’efferocyte par un processus appelé efferocytosis^2,3. Phosphatidylsérine est le meilleur caractérisés manger-me signal conduite efferocytosis. Il se limite normalement au feuillet interne de la membrane plasmique, avec l’apoptose activant un scramblase de lipides qui perturbe cette asymétrie de la membrane, exposant ainsi la phosphatidylsérine à la surface cellulaire⁴. Phosphatidylsérine se trouve sur la surface extracellulaire de certaines cellules non-apoptotique, tels que les macrophages matures et activation des plaquettes. Cependant, ces cellules ne sont pas efferocytosed en raison de la présence de « ne me mangez pas » signaux comme CD47, sur leur cellule surface^5,6,7. Phosphatidylsérine exposée est reconnu par un tableau d’efferocytic récepteurs exprimés par efferocytes. La liaison de ces récepteurs de phosphatidylsérine, soit directement, soit par le biais de l’aide des opsonines, active des voies de signalisation qui favorisent l’enlisement de la cellule apoptotique dans une vacuole de membrane-bondissent, nommée l’efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. l’efferosome fusibles séquentiellement avec les endosomes et les lysosomes, qui fournissent les mécanismes moléculaires nécessaires pour acidifier l’efferosome et de dégrader l’apoptose cellulaire fret^13,14. Une fois dégradée, les matériaux de culture cellulaire apoptotique sont victimes de la traite à l’endosome recyclage — un processus qui limite la réponse immunitaire aux antigènes de culture cellulaire apoptotique, et qui peut permettre la récupération des éléments nutritifs de l’apoptose cellulaire^{13, 15}. Un échec en efferocytosis résultats de la clairance réduite de cellules apoptotiques ; ces cellules désamorcées subissent finalement une nécrose secondaire. Les cellules nécrotiques libèrent pro-inflammatoires contenu cytosolique, des pathogènes et des antigènes dans le milieu extracellulaire, conduisant ainsi une gamme de maladies infectieuses, inflammatoires et autoimmunes^16,17. Ensemble, l’apoptose et efferocytosis facilitent l’élimination des cellules mourantes et morts et permettent le maintien de l’homéostasie tissulaire.

Étudie les mécanismes moléculaires sous-jacents efferocytosis nécessite des méthodes qui fournissent une quantification claire de l’apport des cellules apoptotic. Cette quantification est compliquée par le fait que contrairement aux autre absorption des mécanismes tels que l’endocytose et phagocytose^18,19, efferocytosis ne peuvent conduire à l’enlisement de la cellule cible intactes, ce qui entraîne l’absorption au coup par coup de la cellule apoptotique de la efferocyte²⁰. Le protocole décrit ci-après décrit une analyse d’efferocytosis in vitro qui prévoit la délimitation précise de l’intériorisée par rapport à des portions non intériorisé de cellules apoptotiques individuels et peut être combiné avec une variété de cellules fixes et approches de la microscopie des cellules vivantes. Dosages traditionnels phagocytose ajouter des anticorps spécifiques à la cible phagocytaire à la fin de l’expérience afin d’étiqueter les cibles non-internalisés, alors que notre méthode se distingue par l’étiquetage la cible apoptotique avec biotine covalente^{21 , 22}. alors que les anticorps spécifiques des cellules apoptotic peuvent être utilisés dans cet essai, l’approche biotinylation permet n’importe quelle cible portant des protéines doivent être étiquetées et évite les problèmes potentiels avec réaction croisée des anticorps secondaires si immunostaining est effectuée . Plus précisément, nous exposons la préparation de cellules Jurkat apoptotiques qui ont été à double marquage avec un colorant de repérage des cellules et la biotine. La cellule colorant de repérage permet pour les matériaux de culture cellulaire apoptotique devant être suivi lors du efferocytosis, tandis que la surface biotinylation permettant la discrimination des intériorisé à des parties non intériorisé d’efferocytosed les cellules apoptotiques. Nous décrivons également la culture et la préparation des lignées de cellules J774.2 et THP-1 pour utilisation comme efferocytes murins et humains, les macrophages dérivés de monocytes de M2 à titre d’exemple de cellules primaires efferocytosis et cellules Jurkat pour utilisation en tant que cibles efferocytic. Ces méthodes peuvent facilement être appliquées à d’autres lignées cellulaires ou de cellules primaires, pour cibler les cellules subissant toute forme de mort cellulaire (apoptosepar exemple , une nécrose et necroptosis) et imite taille micron qui simulent les cellules apoptotiques par les revêtements de lipides ou revêtement avec des ligands spécifiques à un récepteur d’efferocytic d’intérêt.

La méthode décrite dans le présent protocole présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes écoulement cytometry basé couramment utilisés dans le champ^23,24. Par imagerie directement l’interaction cellule phagocyte-apoptotiques, combinée à un étiquetage clair des deux matériau à cellules apoptotic total et non intériorisé, mesures quantitatives des efferocytosis sont possibles. En outre, l’utilisation de fluorophores insensible à pH limite des facteurs confondants tels que la suppression de la fluorescence FITC et GFP à pH lysosomal qui confond certaines méthodes alternatives²⁵. Enfin, ne pas décrite en détail, ces méthodes peuvent être employées à l’aide d’efferocytes exprimant des transgènes fluorescent marqué, ou avec l’immunomarquage après fixation, afin de permettre à la quantification de l’activité de la molécule de signalisation et de surveillance de la processus cellulaires au cours de l’efferocytosis.

Protocol

Collecte de sang des volontaires sains a été approuvé par la Health Sciences Research Ethics Board de l’Université de Western Ontario. Ponction veineuse a été effectuée conformément aux directives de l’énoncé de politique des trois conseils sur la recherche humaine. 1. culture et préparation de la lignée Monocyte THP-1 Monocytes THP-1 de la culture comme une culture en suspension dans des flacons de T25 à 37 ° C + 5 % de CO2. Les cellules doivent être cu…

Representative Results

Culture de cellules Jurkat avec résultats la staurosporine 1 µM dans l’apoptose de la nuit > 95 % des cellules, qui peuvent être confirmés avec l’annexine V, coloration (Figure 1). Autres types de cellules peuvent être utilisés pour ces expériences, même si la concentration de la staurosporine et la durée du traitement la staurosporine auront besoin d’être optimisé pour chaque lignée cellulaire. Pour une détection fiable et la quantificatio…

Discussion

Les méthodes décrites dans le présent protocole permettent l’imagerie et la quantification du processus dynamique d’efferocytic, en utilisant des approches tant fixe-cellules et cellules vivantes. Ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux flux couramment utilisés méthodes axées sur la cytométrie en flux^23,24. L’utilisation de dedans-dehors la coloration avec des échantillons fixes permet une quantification plus robuste et plus préci…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152