Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Summary

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Abstract

Studieren die Regulierung des Efferocytosis erfordert Methoden in der Lage sind, die Aufnahme von apoptotischen Zellen genau zu quantifizieren und die Signalisierung und zelluläre Prozesse zu untersuchen, die Efferocytosis zu steuern. Diese Quantifizierung kann schwierig sein, wie Apoptotic Zellen oft bruchstückhaft, Efferocytosed sind durchführen, so erfordern Methoden, die genau zwischen dem Efferocytosed Teil eines Ziels Apoptotic versus passives unengulfed Mobilfunk abgrenzen können Fragmente. Die hier beschriebenen Ansatz nutzt Dual-Kennzeichnung Ansätze, um die Dynamik des Efferocytosis und Efferocytic der Efferocytes wie z. B. Makrophagen genau zu quantifizieren. Das Zytosol der apoptotischen Zelle ist mit einem Handy-Tracking-Farbstoff zu ermöglichen eine Überwachung aller apoptotische Zelle abgeleitet Materialien, während Oberfläche biotinylierungen der apoptotischen Zelle ermöglicht eine Differenzierung zwischen verinnerlichten und nicht verinnerlicht beschriftet apoptotische Zelle Brüche. Die Efferocytic-Kapazität des Efferocytes richtet sich nach fluoreszierende Bilder live oder festen Zellen und die Menge des gebundenen versus internalisierten Ziele zu quantifizieren, wie durch Streptavidin Färbung unterschieden. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile gegenüber Methoden wie Durchflusszytometrie, nämlich die genaue Abgrenzung von nicht-Efferocytosed versus Efferocytosed Apoptotic Zelle Brüche, die Fähigkeit, Efferocytic Dynamik durch live-Cell-Mikroskopie, Messen und die Kapazität, Untersuchungen der zellulären Signalisierung in Zellen, die mit dem Ausdruck eindringmittel beschriftet Transgene durchzuführen. Kombiniert, dienen die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden als Grundlage für eine flexible experimentellen Ansatz, der verwendet werden kann, um Efferocytic Tätigkeit genau zu quantifizieren und zelluläre Signalwege während der Efferocytosis aktiv zu verhören.

Introduction

Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein stark regulierten physiologischen Prozess, der tritt in den meisten vielzelligen Organismen und ist entscheidend für ihre Entwicklung und Homöostase¹. Neben der normalen Zellerneuerung und embryonale Entwicklung beteiligt, Apoptose ermöglicht die Beseitigung der infizierten oder beschädigten Zellen aus den Geweben und in Reaktion auf die Infektion, Entzündung, Krebs, und auch durch medizinische Eingriffe ausgelöst werden kann z. B. Strahlentherapie oder Steroide¹. Apoptotische Zellen aussetzen “Essen-mich” Signale auf ihrer Zelloberfläche die von Rezeptoren auf eine Reihe von professionellen und nichtprofessionellen Phagozyten erkannt werden zusammenfassend als “Efferocytes” bezeichnet. Engagement dieser Rezeptoren induziert die Aufnahme und den Abbau der apoptotischen Zelle durch die Efferocyte durch einen Prozeß bekannt als Efferocytosis^2,3. Phosphatidylserin ist die beste charakterisierten essen-mir signalisieren treibende Efferocytosis. Es normalerweise beschränkt sich auf die innere Broschüre der Plasmamembran, mit Apoptose ein Lipid-Scramblase das stört diese Membran-Asymmetrie, damit aussetzen Phosphatidylserin auf der Zelle Oberfläche⁴aktivieren. Phosphatidylserin ist auf der extrazellulären Oberfläche von einigen nicht-apoptotische Zellen wie Reifen Makrophagen gefunden und Thrombozyten aktiviert. Diese Zellen sind jedoch nicht Efferocytosed aufgrund des Vorhandenseins von “ISS mich nicht” Signale, wie z. B. CD47, auf ihrer Zelle Oberfläche^5,6,7. Exponierten Phosphatidylserin wird durch eine Reihe von Efferocytic Rezeptoren geäußerten Efferocytes erkannt. Bindung dieser Rezeptoren, Phosphatidylserin, aktiviert entweder direkt oder durch die Hilfe von Opsonins, Signalwege, die die Verwicklung der apoptotischen Zelle in eine Membrane-springen Vakuole bezeichnet die Efferosome^8, zu fördern ^{9 , 10 , 11 , 12}. das Efferosome Sicherungen sequenziell mit Endosomen und Lysosomen, die liefern die molekularen Maschinen notwendig, die Efferosome Ansäuern und verschlechtern die Apoptotic Zelle Ladung^13,14. Einmal abgebaut, die Apoptotic Zelle abgeleitet Materialien sind Opfer von Menschenhandel zu recycling Endosom – ein Prozess, welche Grenzen Immunantworten auf apoptotische Zelle abgeleitet Antigene, und die können für die Verwertung von Nährstoffen aus der apoptotischen Zelle^{13, 15}. Ein Fehler im Efferocytosis führt zu eingeschränkter Clearance von apoptotischen Zellen; diese ungeklärten Zellen durchlaufen schließlich sekundären Nekrose. Nekrotische Zellen release Pro-inflammatorischen cytosolischen Inhalt, Krankheitserreger und Autoantigene in das extrazelluläre Milieu, somit eine Reichweite von infektiösen, Entzündungs-und Autoimmunkrankheiten^16,17. Zusammen, Apoptose und Efferocytosis erleichtern die Entfernung der sterbende und tote Zellen und für die Aufrechterhaltung der Homöostase Gewebe erlauben.

Untersuchung der molekularen Mechanismen, die Efferocytosis erfordert Methoden, die eine klare Quantifizierung der apoptotischen Zelle Aufnahme bereitstellen. Diese Quantifizierung wird durch die Tatsache erschwert, dass im Gegensatz zu anderen Aufnahme Mechanismen wie z. B. Endozytose und Phagozytose^18,19, Efferocytosis nicht die Verwicklung von intakten Zielzelle, wodurch die schrittweise Aufnahme führen kann der apoptotischen Zelle durch die Efferocyte²⁰. Die hierin beschriebene Protokoll beschreibt einen in-vitro- Efferocytosis Assay, die genaue Abgrenzung von den verinnerlichten bietet im Vergleich zu nicht verinnerlicht Teile der einzelnen Apoptotic Zellen und kombinierbar mit einer Vielzahl von festen-Zelle und Leben-Zelle Mikroskopie Ansätze. Traditionelle Phagozytose Assays hinzufügen Antikörper spezifisch auf die phagocytic Ziel am Ende des Experiments um Ziele nicht verinnerlicht, wo, wie unsere Methode beschriften unterscheidet sich durch Kennzeichnung der Apoptotic Ziel mit kovalent verknüpft Biotin^{21 , 22}. während apoptotischer Zellen spezifische Antikörper in diesem Assay verwendet werden können, der biotinylierungen Ansatz ermöglicht für jedes Protein-Lager Ziel gekennzeichnet werden und vermeidet mögliche Probleme mit sekundären Antikörper Kreuzreaktivität Immunostaining erfolgt . Im einzelnen erläutern wir die Vorbereitung des apoptotischen Jurkat-Zellen, die mit einer Zelle Tracking Farbstoff und Biotin Dual befleckt gewesen. Die Zelle tracking Farbstoff ermöglicht apoptotische Zelle abgeleitet Materialien, während Efferocytosis verfolgt, während Oberfläche biotinylierungen ermöglicht die Unterscheidung von aus nicht verinnerlicht Teilen des Efferocytosed Apoptotic Zellen verinnerlicht. Wir beschreiben auch die Kultur und die Vorbereitung von J774.2 und THP-1-Zell-Linien für den Einsatz als murinen und menschlichen Efferocytes, M2-Makrophagen Monocyte abgeleitet als Beispiel der Primärzelle Efferocytosis und Jurkat-Zellen für den Einsatz als Efferocytic Ziele. Diese Methoden können leicht auch auf andere Zelllinien oder Primärzellen, Zielzellen durchläuft jede Form des Zelltods (z. B. Apoptose, Nekrose und Necroptosis) und Mikron mittelständische imitiert die Apoptotic Zellen durch Lipid-Beschichtungen zu simulieren oder Beschichtung mit Liganden spezifisch für eine Efferocytic-Rezeptor von Interesse.

In diesem Protokoll beschriebenen Methode hat mehrere Vorteile gegenüber der Flow Cytometry basierend üblichen Methoden im Feld^23,24. Durch bildgebende direkt die Phagozyten-apoptotische Zelle Interaktion, kombiniert mit klaren Kennzeichnung von beiden insgesamt und nicht verinnerlicht Apoptotic Zellmaterial können quantitative Maßnahmen des Efferocytosis vorgenommen werden. Darüber hinaus schränkt die Verwendung von pH-unempfindliche Fluorophore Störfaktoren wie die Unterdrückung der FITC und GFP Fluoreszenz bei lysosomalen pH, die einige alternative Methoden²⁵verwirrt. Schließlich, während nicht im Detail beschrieben, diese Methoden eingesetzt werden mit Efferocytes mit dem Ausdruck eindringmittel beschriftet transgene oder mit Post-Fixierung Immunostaining, Quantifizierung der Signalisierung Molekül Aktivität und Überwachung ermöglicht die zelluläre Prozesse während der Efferocytosis.

Protocol

Ansammlung von Blut von gesunden Probanden nahm Health Science Research Ethics Board von der University of Western Ontario. Venenpunktion wurde gemäß den Richtlinien der Tri-Rat Grundsatzerklärung zur Forschung am Menschen durchgeführt. 1. Kultur und Vorbereitung der Zelllinie THP-1 Monocyte Kultur THP-1 Monozyten als einer SUSPENSIONSKULTUR in T25 Fläschchen bei 37 ° C + 5 % CO2. Zellen sollten in Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % 5 mL fetalen …

Representative Results

Über Nacht Kultur Jurkat Zellen mit 1 µM Staurosporine Ergebnisse bei der Apoptose von > 95 % der Zellen, die mit Annexin V Färbung (Abbildung 1) bestätigt werden kann. Andere Zelltypen können für diese Experimente verwendet werden, obwohl die Konzentration der Staurosporine und die Dauer der Staurosporine Behandlung für jede Zelllinie optimiert werden müssen. Für die zuverlässige Erkennung und Quantifizierung von Efferocytosis > 80 % der Zellen sol…

Discussion

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ermöglichen die Bildgebung und Quantifizierung des dynamischen Efferocytic-Prozesses mit fest-Zelle und live-Cell Ansätzen. Diese Ansätze bieten mehrere Vorteile gegenüber den verwendeten Flow Cytometry-basierte Methoden^23,24. Die Verwendung der Inside-Out-Färbung mit festen Proben bietet eine robuste und präzise Quantifizierung der Rate und das Ausmaß der Efferocytosis — in der Tat viele Flow Cytometry-basi…

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152