여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.
세포종 (GBM) 가난 하 게 현재 사용할 수 있는 치료 옵션으로 제어 되는 적극적인 뇌종양 이다. GBMs의 주요 특징은 급속 한 확산 등 정상적인 두뇌에 퍼지는 침략. 되풀이 라디오 및 화학 내성 뇌 종양 줄기 세포 (BTSCs) 초기 암 질량에서 침략 하 고, 따라서, 외과 절제술을 피하기 위해 그의 존재에서 유래 생각. 따라서, BTSCs 및 그들의 침략 적 능력 대상 요법이이 질병의 그렇지 않으면 빈약한 예 지를 높일 수 있습니다. 우리 그룹 등 성공적으로 설립 있고 GBM 환자 샘플에서 음성 문화 특징. 이러한 음성 문화 clonogenic 자체-갱신, 다중 계보 차별화 등 면역 결핍 쥐에 종양 개시 근본적인 암 줄기 세포 속성을 보여 줍니다. 개선 하기 위해 현재 치료 접근에 GBM를 위한, 더 나은 음성 마이그레이션 및 침략의 메커니즘의 이해는 필요 합니다. GBM, 마이그레이션 및 침략의 연구 부분, 완전히 neurospheres로 성장 하는 BTSCs의 생체 외에서 의 성장 특성에 대 한 계정을 하지 않습니다 기존 기술의 제한으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리 BTSCs의 마이그레이션 및 침략 속성을 공부를 신속 하 고 양적 라이브 셀 이미징 분석을 설명 합니다. 설명 하는 첫 번째 방법을 측정 chemoattractant 그라데이션으로 마이그레이션 하는 음성 마이그레이션 분석 결과 이다. 설명 하는 두 번째 방법을 음성 침공 분석 결과 이미지 이며 행렬에 neurospheres에서 셀룰러 침략 단정. 여기서 설명 하는 분석 실험 음성 마이그레이션 및 내 습 시간이 지남에 조건 하에서 다른 치료의 정량화에 사용 됩니다.
세포종 (GBM) 뇌종양의 가장 일반적이 고 적극적인 형태는 현재 치료에도 불구 하 고 방사선 다음 외과 절제술을 포함 그리고, 화학 요법, 환자의 평균 생존은 불과 15 개월1. GBM은 침략, 높은 약물 내성, 그리고 궁극적으로, 필요로 하는 불 치의 질병 연구를 계속 했다 자사의 고유한 생물학에 소설 치료도 식별. GBM 환자의 높은 사망 율 주로 인접 한 정상 뇌 조직 및 치료2,3 다음 질환의 재발에 이르게 혈관에 따라 마이그레이션에 광범위 한 세포 침입에 의해 발생 . 자전거 및 치료 저항 하는, 느린 뇌 종양 줄기 세포 (BTSCs), 나 셀의 하위 집합 질병 재발으로 이어질 가설 되어 있다. GBM BTSCs clonogenic 자체-갱신, multipotency, 및 잠재적인4,5,종양을 시작6의 속성을 표시합니다. BTSCs는 또한 그들의 부모 GBM 종양7,8,,910의 유전, 분자, 및 phenotypic이 유지. 이러한 속성은 GBM의 연구와 탐험 비 발한 치료 전략에 대 한 매우 유용한 모델 시스템 BTSCs를 확인 합니다. Vivo에서이 같은 줄기 세포는 종양의 형성, 성장, 및 침략 신생아 쥐11 의 두뇌로 이식 때와 비 뚱뚱한 당뇨병/심한 결합 (끄 덕 임/SCID) 면역 결핍 쥐4. 반복적으로 침략 적인 종양에서 vivo에서 강하게 그들의 원래 종양 세포 및 조직학 특징을 정리 하는 형성 하는 BTSCs의 기능 세포 종양을 시작12로 그들의 역할을 지원 합니다.
소설 치료 접근 대상 BTSCs 개발 되 고 있다 고 GBM 환자에 대 한 장기 결과 개선 하는 데 도움이. 현재, 거기에 치료 저항 및 재발 관련 된 세포 이동과 내 습 프로세스의 이해 제한 됩니다. 마이그레이션 및 내 습은 뚜렷한 현상; 마이그레이션 셀의 감독된 운동 기본 프로세스 이며 침략은 방 벽의 물리적 파괴에도 필요 합니다 반면 골격, 접착 분자, 및 초점 접점의 조립/분해의 개편을 포함 세포 외 기질13등. 셀 이동과 침략의 널리 허용된 방법론 Boyden 챔버 시험14,15입니다. 이 기술에 대 한 더블 챔버는 chemoattractant 보충 아래쪽 챔버에 미디어와 미디어 채워집니다. Chemotaxis는 일반적인 chemoattractant로 특정 성장 인자, cytokines, 또는 소 태아 혈 청을 사용 하 여 발생 합니다. chemoattractant의 그라데이션에 따라 세포 다공성 멤브레인 통해 마이그레이션할. 끝점에서 마이그레이션된 셀 시각 및 cytological 또는 형광 성 염료로 염색 하 여 막의 아래쪽에 정량 될 수 있습니다. Boyden 마이그레이션 분석 결과 다공성 코팅 침공 분석 결과를 수정할 수 있습니다 필터링 유형 같은 기질 구성 요소와 나 콜라겐 또는 지하실 멤브레인와 같은 매트릭스. 침략 적 세포 매트릭스를 저하, 통해 다공성 필터의 아래쪽에 이동한 마이그레이션 분석 결과를 비슷한 방식으로 측정할 수 있습니다. 다른 일반적으로 사용 되는 마이그레이션 분석 스크래치 상처를 포함 하 고 셀 제외 영역 분석 실험13. 스크래치 상처 분석 결과 세포 단층에 격차를 긁 고 스크래치 닫힐 때까지 정기적으로 이미징 하 여 상처의 가장자리에서 셀의 마이그레이션을 관찰 하 여 수행 됩니다. 셀 제외 분석 결과, 물리적 장벽 시드 셀의 이전 셀 자유 영역을 만드는 데 사용 됩니다. 방 벽은 한 번 제거 셀 confluent 이며 셀 자유 영역에는 셀의 마이그레이션 몇 정기적으로16군데.
이 이전 분석 공부 마이그레이션 또는 부착 하 고 동종 세포 인구 하지만 포즈 상당한 단점의 침공 GBM BTSCs 또는 기타 다른 유형의 암 세포 인구를 공부를 할 때 자주 사용 되는 설립. Boyden 챔버 분석 결과 끝점 측정 대 세포 이동의 운동 평가 생성할 수 있습니다. 시간이 지남에 관찰은 음성 이동의 측정에 대 한 높은 관련성의 주어진 다른 문화에서 셀 종종 서로 다른 속도로 이동. 따라서, 조건 및 타이밍 분석 결과의 각 문화 유형에 최적화 해야 하며 많은 시간과 노동 적절 한 샘플링 및 정량화에 대 한. 경우에 BTSCs laminin 코팅 접시에 단층 조건 하에서 교양, 우리 BTSCs 오픈 공간으로 움직임을 저항 하 고에 남아 선호 되도록 관찰해 서 분석 실험 음성 문화에 적합 하지 않습니다 스크래치 및 셀 제외 닫기 다른 셀에 근접입니다. 또한, 이러한 설립 마이그레이션 분석 시각화 및 실험을 통해 개별 셀의 모니터링에 대 한 허용 하지 않습니다. 와 같은 음성 문화 대 한 Boyden 챔버, 스크래치, 그리고 셀 제외 영역 분석의 BTSCs. 추가 불리는 시간이 지남에 개별 셀 모니터링 하는 것은 다른 유형의 세포 인구에 있는 이동의 평가 대 한 귀중 한 그들은 상대적으로 필요 높은 셀 번호, 설정, 수 수 하 고도 급속 하 게 equilibrate 또는 chemoattractant 그라데이션. 따라서, 이러한 분석 이상 희귀 또는 느린 성장 세포 인구 또는 약물 검사에 대 한 사용 되지 않습니다. 또한, 이러한 분석은 측정 neurosphere 조건 하에서 성장 하는 BTSCs에 대 한 특히 중요 한 3 차원 (3D) 형식, 침략 적합 하지.
여기, 우리가 구체적으로 관찰과 개별 BTSCs, 및 neurospheres로 경작 하는 GBM BTSCs의 침공에 대 한 마이그레이션의 정량화에 대 한 수정 분석 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 혈 세포 마이그레이션13측정 하 라이브 셀 시간 경과 이미징 및 chemotaxis 마이그레이션 플레이트를 사용 하 여 Boyden 챔버 분석 결과의 적응을 설명 합니다. 다 잘 형태로 라이브 셀 이미징 시각화와 여러 치료 조건 하에서 세포 이동의 정량화 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 두 번째 분석 결과 회전 타원 체 침공 분석 결과13,17, BTSCs의 침략 적 속성 neurosphere 조건 하에서 배양 하 고 다양 한 치료에서 3 차원 기질에 포함 측정 하 조건입니다. 전반적으로,이 분석 실험은 이기종 음성 문화의 속성과 침략 철새 공부에 대 한 앞에서 설명한 방법론 보다 훨씬 더 호환 됩니다. 그들은 또한 모두 마이그레이션 및 침략, 질병 재발과 치 사 율에 크게 공헌 하는 새로운 치료 전략의 수사를 위한 더 나은 기회를 제공 합니다.
암 세포는 적극적으로 확산 하 고, 그에 주어진이 세포 이동의 연구에 대 한 잠재적인 기술 도전 포즈. 여기에 설명 된 마이그레이션 분석 결과 대 한 BTSCs 성장 인자 없이 도금은, 확산을 제한 하 고 chemotaxis 접시의 chemoattractant 그라데이션 72 시간 이상 완전히 equilibrate 하지는 않습니다. 또한, 셀 시간이 지남에 라이브 셀 이미징 사용 하 여 모니터링 하 고로 셀 모니터링할 수 있습니다 시각적으로 광범위 한 세포 분열 하지 발생 되도록. 마이그레이션 분석 결과의 성공에 대 한 그것은 완전히 단일 셀에 neurospheres를 해리 하 고 도금 하기 전에 핸드폰 번호를 정확 하 게 계산 하는 것이 중요. 도금 분야 또는 너무 많은 셀을 도금, 응집, 어떤 결과 (그림 4A 및 4B) 작은 숨 구멍을 통해 마이그레이션에서 셀을 방지할 수 있습니다. 그것은 또한 chemotaxis 마이그레이션 플레이트에 셀을 도금 또는 아래쪽 저수지에 막 삽입을 배치할 때 거품을 만들지 않도록 하는 것이 중요. 거품 초점의 비행기를 변경 하 고 정확한 정량화 (그림 4C)을 방지할 수 있습니다. 전체 접시 제공 하기 때문에이 세포는 접시에 있는 숨 구멍에 이동 하는 표면 준수 하는 chemoattractant으로 생물학으로 관련 된 표면에 걸쳐 마이그레이션한 다음 셀을 필요로 하는이 분석 결과 콜라겐의 얇은 층으로 코팅을 해야 합니다.
여기에 설명 된 음성 마이그레이션 프로토콜 개별 셀 마이그레이션, 적은 셀 기존 프로토콜에 비교 될 때 다른 치료 조건 테스트를 위한 요구의 운동 평가 대 한 수 있습니다. 이 실험에 대 한 셀의 많은 수를 수집 하는 것이 어려울 수 있습니다 매우 느리게 성장 하는 문화에 대 한 중요 하다. Chemotaxis 마이그레이션 플레이트의 낮은 기 공 밀도 chemoattractant 그라데이션, 72 h, 보다 큰의 느린 평형에 대 한 허용 하 고 보다 효과적으로 시간의 긴 기간 동안 혈 마이그레이션의 생물 학적 과정을 모방. 프로토콜 분석 결과 조치 이동과 침략 하지 있도록 chemotaxis 마이그레이션 접시에 콜라겐 코팅의 아주 얇은 층을 최적화 했다. 그것은 또한 촉진 한다 이미징 및 단일 세포의 부 량으로 그들은 코팅 막 삽입 콜라겐 매트릭스를 준수. 그러나, 기술에의 한 제한 시간이 지남에 따라 여러 우물에서 마이그레이션의 정량화는 매우 단순 하 고 빠른 상용 소프트웨어를 사용 하 여은 ( 재료의 표참조). 마이그레이션 분석 결과의 주목할 만한 장점은 여기에 설명 된 대로 다른 셀 형식 프로토콜의 넓은 적응성입니다. 그것은 어느 느린 성장, 준수, 또는 천천히 마이그레이션할 어려운 셀 줄의 혈 마이그레이션 측정을 위해 특히 유용할 것 이다.
음성 침공 분석 결과의 성공을 위해, 그것은 200 µ m. 더 큰 분야는 지속적으로 이미지 (그림 5C) 계량을 너무 큰 초점의 비행기 보다 더 큰 되기 전에 neurospheres를 수집 하는 데 필요한. 또한, neurospheres는 덩어리와 다른 neurospheres와 집계를 시작할 수 있습니다. 이 정확 하 고 일관 된 데이터의 수집을 영향을 줍니다. 또한, 그것은 필수적인 콜라겐 초점 (그림 5D)의 단일 면에 이미지를 neurospheres 수 있도록 얼음에 여전히 동안 우물의 바닥에 침전 하는 neurospheres 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 완벽 하 게이 이미지 품질 (그림 5D)에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 심지어 매트릭스의 형성을 방해 수로 접시를 이동 하지 않고 설정에 콜라겐을 허용 하는 것이 중요. 여기에 설명 된 음성 침공 분석 결과 대 한 주요 장점 중 하나는 BTSCs neurospheres로 교양 평가 될 수 있다 침략에 대 한 직접, adherently 성장 하는 필요 없이입니다. 또한, 음성 neurospheres 어떤 기질, 특정 조직에서 세포 외 매트릭스의 개별 구성 요소를 사용 하거나 상용 지하실 멤브레인 혼합물을 사용 하 여에 포함 될 수 있습니다. 세포 외 매트릭스를 지정 하 여 식별 하거나 침략의 특정 메커니즘을 테스트 도울 수 있다. 예를 들어이 프로토콜 특정 매트릭스 구성 요소를 저하 알려진 유전자의 매트릭스 metallopeptidase 가족의 개별 회원을 대상으로의 효과 평가 하기 위해 가능 하다. 또는,이 프로토콜은 음성 neurospheres, 비록 어떤 셀 영역으로 성장 비슷한 패션에 사용할 수 있습니다. 예로 유방암 세포 mammospheres 또는 tumorspheres;으로 교양된 주 대 장 암 세포 배양 그러나,이 셀 유형에 문화에서 영역으로 성장할 수 있는 방법을 제한 합니다. 마이그레이션 및 침입 분석 실험의 다른 장점은 그들은 설치 하기 쉽, 그들은 96-잘 형식에서 작동 및 데이터는 시간이 지나면서 같지는입니다.
전반적으로, 후 처리 GBM 재발을 방지 하기 위하여 음성 마이그레이션 및 침략의 조사를 용이 하 게 하는 방법론을 개발 필수적 이다. 여기에 설명 된 마이그레이션 프로토콜 이전 설립된 마이그레이션 분석 실험, 특히 GBM BTSCs의 연구에 대 한 많은 이점을 제공 합니다. 이 향상 된 마이그레이션 프로토콜 해리 BTSCs neurosphere 조건 하에서 경작 하 고 96 잘 콜라겐 코팅 chemotaxis 마이그레이션 접시에 단일 셀을 도금 하는 작업이 포함 됩니다. 라이브 셀 이미징 시스템을 사용 하 여, BTSCs의 마이그레이션 모니터링 되 고 시간이 지남에 계량. 여기에 설명 된 침공 분석 결과 행렬에 neurospheres에서 음성 침략의 모니터링 할 수 있습니다. 이 분석 결과 96 잘 접시에서 콜라겐 매트릭스, 또는 다른 단백질이 풍부한 기질, neurospheres를 포함 하는 작업이 포함 됩니다. 라이브 셀 시간 경과 이미징 시스템과 판 영상 시간이 지남에 다른 처리 조건 하에서 음성 침략의 분석에 대 한 수 있습니다. 이 분석 실험은 따라서, 과학자 음성 마이그레이션 및 침략을 기본 메커니즘을 이해 하기 바라고 귀중 한 도구를 제공 합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 그들의 기술 지원에 대 한 Rozina Hassam와 Orsolya Cseh 감사합니다. 이 연구 프로젝트는 (H. Artee Luchman 사무엘와 이즈)를 혁신 하 고 (또한 H. Artee Luchman 사무엘와 이즈)를 캐나다의 줄기 세포 네트워크에 대 한 캐나다 재단에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 했다.
Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |