Beredning av en hög kvalitet primära cellodling från fisk nekrohypofyser
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda och underhålla primära hypofysen cellkulturer från medaka (Oryzias latipes). De optimera villkor i detta protokoll beakta viktiga parametrar såsom temperatur, osmolalitet och pH genom att härma de fysiologiska förhållandena av fisken, varigenom fysiologiskt mer meningsfulla resultat.
Abstract
Primär cellkultur är ett kraftfullt verktyg som ofta används av forskare för att studera cellulära egenskaper och mekanismer av isolerade celler i en kontrollerad miljö. Trots stora skillnader i fysiologi mellan däggdjur och fiskar bygger primär cell kultur protokoll från fisk ofta på däggdjur odlingsbetingelser, ofta med endast smärre ändringar. Miljömässiga skillnaderna påverkar inte bara kroppens temperatur, men även blodserum parametrar såsom osmolalitet, pH och pH buffertkapacitet. Eftersom cellen kulturmassmedia och liknande fungerande lösningar är tänkta att efterlikna egenskaper av extracellulär vätska eller blod serum som en cell är anpassad, är det viktigt att dessa parametrar är anpassade specifikt för djuret i fråga.
Det nuvarande protokollet beskriver optimerad primära odlingsbetingelser för medaka (Oryzias latipes). Protokollet ger detaljerade anvisningar om hur man isolera och behålla friska dissocierade hypofysen celler för mer än en vecka och omfattar följande steg: 1. justering av osmolalitet att värdena Funna i medaka blodplasma, 2. justering av den inkubation temperatur till normala medaka temperatur (här i akvarium anläggningen), och 3. justering av pH och bikarbonat bufferten till värden som är jämförbar med andra fiskarter som lever på liknande temperaturer. Resultaten presenteras med hjälp av protokollet beskrivs främja fysiologiskt meningsfulla resultat för medaka och kan användas som en referens av forskare att göra primära cellkulturer från andra icke däggdjur arter.
Introduction
Cellkultur är en av de viktigaste verktygen som används i molekylärbiologisk forskning, som ger en utmärkt modellsystem för att besvara olika biologiska frågor alltifrån normal cellulär fysiologi till drug screening och carcinogenes1. Primära celler, isolerade direkt från den animalisk vävnad med hjälp av enzymatiska eller mekaniska metoder, anses ofta mer biologiskt relevant än cellinjer som biologiska svaret kan vara närmare i vivo situationen. Protokoll för att förbereda primära cellkulturer bör optimeras för varje art och cell typ av intresse för att efterlikna de egenskaper som en cell är anpassad och få fysiologiskt meningsfulla resultat.
Många protokoll beskriva odlingsbetingelser för däggdjursceller system, medan liknande protokoll som beskriver primära odlingsbetingelser för fisk celler är ganska knappa i jämförelse. Celler är känsliga för snabba förändringar i temperatur, pH och osmolalitet, och är särskilt ömtåliga under förfarandet för dissociation. Kommersiella saltlösningar och odlingssubstrat som används för däggdjursceller kulturer är inte optimala för lever fisk, särskilt när det gäller pH buffert system och osmolalitet. Det är därför viktigt att mäta och justera lösningar på fysiologiskt relevanta nivåer av dessa parametrar i arter av intresse.
Primära hypofysen kulturer har gjorts från flera lever fiskarter, inklusive karp (Cyprinus carpio)2,3, gräs karp (Ctenopharyngodon idella)4, guldfisk (Carassius auratus )5, regnbåge (Oncorhynchus mykiss)6, europeisk ål (Anguilla anguilla)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebrafisk (Danio rerio)9, och Torsk (Gadus morhua)10. Förutom att justera inkubation temperaturen för arter av intresse, har flera av dessa protokoll inkuberas cellerna på däggdjurs-liknande förhållanden som kan vara suboptimal för arter av intresse, med ett pH från 7,2 till 7.5 i en fuktad atmosfär som innehåller 3-5% CO2. Dessutom är det oklart om osmolalitet av lösningar används för att förbereda flera av dessa primära cellkulturer justerades och stabil mellan olika lösningar.
Det nuvarande protokollet är baserat på tidigare arbete med primära kulturer från atlanttorsk10 och består av justeringar av inkubering temperatur, osmolalitet, pH och pH buffertsystem, inklusive partialtrycket av koldioxid (pCO2), till fysiologi medaka (O. latipes). Medaka är en liten (3-4 cm) sötvattensfisk, infödda till östra Asien. Dessa dagar, används det som en modell art i många forskningslaboratorier runt om i världen eftersom det är relativt lätt att föda upp och mycket motståndskraftig mot många vanliga fisk sjukdomar11. Det finns flera fördelar med att använda medaka som modell, inklusive en Temperaturtolerans från 4 – 40 ° C11, en kort generationstid, transparent embryon, en sex-bestämma gen12, och ett sekvenserat genomet13, liksom många andra tillgängliga genetiska resurser.
De primära kultur villkor i detta protokoll är optimerade för att matcha temperatur 26 ° C som medakas hålls på i fisk anläggningen. Ytterligare, osmolalitet minskas från 320 mOsm/kg från torsk som lever i saltvatten till 290 mOsm/kg för medaka lever i sötvatten och är i enlighet med normal osmolalitet medaka plasma14. I jämförelse är typiska osmolalitet däggdjurs plasma i spänna av 275 – 295 mOsm15. Fiskar lever i en mängd olika temperaturer och har gälar som är i direkt kontakt med vatten, vilket gör den pH och buffert kapaciteten av blod och extracellulär vätska i fisk skiljer sig från dem hos däggdjur. Däggdjur kultur media brukar innefatta buffertsystem som resulterar i ett pH på cirka 7,4 när media är utjämnad till en standard atmosfär för 5% CO2 i fuktad luft vid 37 ° C. PH är temperaturberoende och värdet för neutralt pH (i vatten) ökar med en minskande temperatur16. Typiska lever fisk plasma pH varierar från 7,7 till 7,917. Optimering av detta protokoll ingår en minskning från pH 7,85 för torsk som hålls vid 12 ° C till pH 7,75 för medaka höll vid 26 ° C ökade CO2 från 0,5% till 1%.
Bikarbonat buffertkapacitet är dessutom helt annorlunda i fiskar och däggdjur. CO2 byts enkelt över gälarna i fisk och den pCO2 i vatten är bara en bråkdel av pCO2 i lungan18. Ändra antingen temperaturen eller pCO2 ändrar pH och buffert av medium. Följaktligen varken pH eller pCO2 rekommenderas för ruvning däggdjursceller är optimal för fisk celler och därför kultur media bör optimeras med buffertsystem som innehåller fysiologiskt relevanta värden för fisk och vissa arter av intresse. Det här protokollet beskriver hur du förbereder primära cellkulturer från medaka nekrohypofyser och inkluderar justeringar av inkubering temperatur, osmolalitet, pH och pH buffert systemet, förutom andra viktiga parametrar att beakta när de förbereder primär cell kulturer från icke däggdjur arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro cell kultur system ger kraftfulla verktyg för forskare att besvara en uppsjö av olika biologiska frågor om används på rätt sätt1. Det är viktigt att komma ihåg att dissocierade celler som har förlorat sina anslutningar till angränsande celler kan har fått olika funktionella egenskaper än de ursprungligen hade i vivo. För att undvika att risk för feltolkning resultat från in vitro- experiment, är det viktigt att överväga justera primär cell ku…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har finansierats av norska University of Life Sciences och av Norges forskningsråd, licensnummer 243811 och 244461 (vattenbruk program). Vi är tacksamma till Lourdes vagn Tan vid norska University of Life Sciences för att upprätthålla fisk anläggningen.
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straigt tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles / insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout – Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis – past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. . Fish respiration. , (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neurosciences. 168 (4), 862-870 (2010).
