إعداد ثقافة الخلية الأولية عالية الجودة من الأسماك بيتويتاريس

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول لإعداد والحفاظ على ثقافات خلايا الغدة النخامية الأولية من الميداكا (Oryzias latipes). الشروط الأمثل في هذا البروتوكول تراعي المعالم الهامة مثل درجة الحرارة، أوسمولاليتي، ودرجة الحموضة عن طريق محاكاة الظروف الفسيولوجية للأسماك، مما يمكن من نتائج أكثر جدوى من الناحية الفسيولوجية.

Abstract

ثقافة الخلية الأولية أداة قوية تستخدم عادة من قبل العلماء لدراسة الخصائص الخلوية والآليات للخلايا المعزولة في بيئة تسيطر عليها. على الرغم من الاختلافات الشاسعة في الفسيولوجيا بين الثدييات والأسماك، بروتوكولات الثقافة الخلية الأولية من الأسماك كثيرا ما تستند إلى ظروف الثقافة الثدييات، غالباً مع تعديلات طفيفة فقط. الاختلافات البيئية تؤثر على درجة حرارة الجسم، ليس فقط، بل أيضا المعلمات مصل الدم مثل أوسمولاليتي ودرجة الحموضة pH سعة المخزن المؤقت. كما خلية ثقافة الإعلام وحلول العمل مماثلة تهدف إلى تقليد خصائص السوائل خارج الخلية و/أو مصل الدم الذي خلية تكييفها، من الأهمية بمكان أن يتم ضبط هذه المعلمات على وجه التحديد للحيوان في السؤال.

البروتوكول الحالي توضح شروط الثقافة الأولية الأمثل الميداكا (Oryzias latipes). البروتوكول يوفر خطوات تفصيلية حول كيفية عزل والحفاظ على صحة فصل خلايا الغدة النخامية لأكثر من أسبوع، ويتضمن الخطوات التالية: 1. تعديل osmolality إلى القيم الموجودة في بلازما الدم الميداكا، 2. التعديل درجة حرارة الحضانة إلى درجة الحرارة العادية الميداكا (هنا في المرفق الحوض)، و 3. تعديل درجة الحموضة وبيكربونات المخزن المؤقت إلى قيم قابلة للمقارنة بالأنواع الأخرى من الأسماك تعيش في درجات حرارة مماثلة. النتائج المعروضة باستخدام بروتوكول وصف تعزيز نتائج مجدية من الناحية الفسيولوجية الميداكا، ويمكن أن يستخدمها العلماء مما يجعل الثقافات الخلية الأولية من الأنواع غير الثدييات الأخرى كدليل مرجعي.

Introduction

ثقافة الخلية واحدة من الأدوات الرئيسية المستخدمة في البحوث البيولوجية الجزيئية، وتوفير نظام نموذجا ممتازا للإجابة على أسئلة بيولوجية مختلفة تتراوح بين الفيزيولوجيا الخلوية العادية ل الفحص والتسرطن المخدرات¹. غالباً ما تعتبر الخلايا الأولية، معزولة مباشرة من الأنسجة الحيوانية باستخدام أساليب الانزيمية و/أو الميكانيكية، بيولوجيا أكثر أهمية من خطوط الخلايا الاستجابة البيولوجية قد تكون أقرب إلى الحالة في فيفو . ينبغي أن يكون الأمثل بروتوكولات من أجل إعداد الثقافات الخلية الأولية لكل نوع خلية والأنواع ذات الاهتمام من أجل محاكاة الخصائص التي خلية تكييف والحصول على نتائج مفيدة من الناحية الفسيولوجية.

بروتوكولات عديدة توضح شروط الثقافة نظم خلايا الثدييات، بينما بروتوكولات مماثلة تصف ظروف الثقافة الأولية للخلايا الأسماك شحيحة بل في المقارنة. الخلايا عرضه للتغيرات السريعة في درجة الحرارة ودرجة الحموضة وأوسمولاليتي، وهشة لا سيما أثناء إجراء الانفصال. حلول الملح التجاري وثقافة وسائل الإعلام المستخدمة لخلايا الثدييات الثقافات ليست الأمثل للأسماك تيليوست، لا سيما من حيث درجة الحموضة العازلة نظام كفؤ و osmolality. ولذلك، من المهم لقياس وضبط الحلول إلى المستويات ذات الصلة الفيزيولوجية لهذه المعلمات في الأنواع ذات الأهمية.

الثقافات الغدة النخامية الأولية قد بذلت من العديد من أنواع الأسماك تيليوست، بما في ذلك الكارب العادي () (Cyprinus carpio)^2،3، عشب الكارب (idella كارب)⁴ذهبية (الذهبي Carassius )⁵، تراوت قوس قزح (Oncorhynchus mykiss)⁶, ثعبان (أنغيلا أنغيلا)⁷، البلطي (Oreochromis mossambicus)⁸،⁹من الزرد (دانيو rerio)، و سمك القد الأطلسي (جادوس مروة)¹⁰. وبصرف النظر عن ضبط درجة حرارة الحضانة لهذه أنواع الفوائد، العديد من هذه البروتوكولات قد المحتضنة الخلايا في ظروف شبيهة بالثدييات التي قد تكون دون المستوى الأمثل لهذا نوع الاهتمام، مع درجة حموضة من 7.2 إلى 7.5 في جو هوميديفيد تحتوي على 3-5% CO₂. وبالإضافة إلى ذلك، أنها غير واضحة إذا عدلت osmolality الحلول المستخدمة في إعداد العديد من هذه الثقافات الخلية الأولية ومستقرة بين حلول مختلفة.

البروتوكول الحالي يستند إلى العمل السابق مع الثقافات الأولية من سمك القد الأطلسي¹⁰ ويشمل تعديلات لدرجة حرارة الحضانة و osmolality ودرجة الحموضة والحموضة العازلة النظم، بما في ذلك الضغط الجزئي لثاني أكسيد الكربون (pCO₂)، إلى فسيولوجيا الميداكا (O. latipes). الميداكا من أسماك المياه العذبة صغيرة (3-4 سم) أصلي إلى شرق آسيا. في هذه الأيام، يتم استخدامه كأنواع نموذجية في العديد من المختبرات البحثية العالم، كما أنه من السهل نسبيا لتربية ومقاومة عالية للعديد من الأمراض السمكية المشتركة¹¹. هناك العديد من المزايا لاستخدام الميداكا كنموذج، بما في ذلك تسامح درجة حرارة من 4 – 40 درجة مئوية¹¹، وقت قصير الجيل، الأجنة شفافة، تحديد الجنس الجيني¹²، و تسلسل الجينوم¹³، كذلك العديد من الآخرين الموارد الجينية المتاحة.

شروط الثقافة الأولية في هذا البروتوكول هي الأمثل لتتناسب مع درجة الحرارة 26 درجة مئوية في إبقاء في ميداكاس في مرفق الأسماك. علاوة على ذلك، osmolality خفضت من موسم 320/كغ من سمك القد الأطلسي التي تعيش في المياه المالحة لموسم 290/كغ بالنسبة الميداكا التي تعيش في المياه العذبة وهو وفقا osmolality العادي الميداكا البلازما¹⁴. وبالمقارنة، osmolality نموذجية للبلازما الثدييات في النطاق من 275-295 موسم¹⁵. الأسماك يعيش في مجموعة متنوعة من درجات الحرارة والخياشيم التي على اتصال مباشر مع الماء، مما يجعل قدرة على درجة الحموضة والمخزن المؤقت للدم والسوائل خارج الخلية في الأسماك مختلفة عن تلك الموجودة في الثدييات. عادة ما تتضمن الثدييات ثقافة الإعلام نظم المخزن المؤقت الذي ينتج الرقم الهيدروجيني من حوالي 7.4 عند وسائل الإعلام هي اكويليبراتيد إلى جو قياسية من 5% CO₂ في الهواء هوميديفيد عند 37 درجة مئوية. هو الرقم الهيدروجيني درجة الحرارة تعتمد والقيمة من أجل زيادة الأس الهيدروجيني المحايدة (في المياه) مع انخفاض درجة حرارة¹⁶. الأسماك تيليوست نموذجي البلازما pH يتراوح من 7.7 إلى 7.9¹⁷. وشملت الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول الحد من درجة الحموضة 7.85 لسمك القد أبقى على 12 درجة مئوية إلى درجة الحموضة 7.75 الميداكا أبقى على 26 درجة مئوية بزيادة أول أكسيد الكربون₂ من 0.5% إلى 1%.

وباﻹضافة إلى ذلك، سعة المخزن المؤقت بيكربونات يختلف تماما في الأسماك والثدييات. CO₂ يتم تبادلها بسهولة عبر الخياشيم في الأسماك و pCO₂ في الماء سوى جزء صغير من pCO₂ في الرئة¹⁸. تغيير درجة الحرارة أو pCO₂ سيقوم بتغيير درجة الحموضة والمخزن المؤقت من المتوسط. ونتيجة لذلك، درجة الحموضة ولا pCO₂ وأوصت تفرخ خلايا الثدييات الأمثل لخلايا الأسماك، وذلك، ينبغي أن يكون الأمثل وسائل الإعلام الثقافة مع نظم المخزن المؤقت الذي يحتوي على القيم ذات الصلة الناحية الفسيولوجية للأسماك نوع معين من الفائدة. هذا البروتوكول توضح كيفية إعداد الثقافات الخلية الأولية من بيتويتاريس الميداكا وتشمل التعديلات حضانة osmolality ودرجة الحموضة، درجة الحرارة ودرجة الحموضة المخزن المؤقت للنظام، بالإضافة إلى المعلمات الأخرى الهامة في الاعتبار عند إعداد الخلية الابتدائية الثقافات من الأنواع غير الثدييات.

Protocol

ووافقت جامعة النرويج لعلوم الحياة، والمبادئ التوجيهية التالية للعناية والرعاية لأبحاث الحيوانات التجارب على الحيوانات في هذه الدراسة. 1-إعداد الحلول معايرة أدوات متر أوسموميتير والحموضة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لضمان صحة القياسات. إعداد 500 مل من Ca2 +…

Representative Results

وصف إعداد ثقافة الخلية الأولية من بيتويتاريس الميداكا هذا البروتوكول وتوفير الخلايا السليمة التي يمكن الحفاظ على ثقافة لمدة أسبوع واحد على الأقل. البروتوكول يستند إلى القيم ذات الصلة الفسيولوجية الميداكا14 وهو الأمثل بالإضافة إلى ذلك إلى أنسجة الغدة النخا?…

Discussion

في المختبر خلية ثقافة أنظمة توفر أدوات قوية للباحثين للإجابة على عدد كبير أسئلة البيولوجية المختلفة إذا ما استخدمت ب الطريقة الصحيحة¹. من المهم أن نتذكر أن ينتابها الخلايا التي فقدوا صلاتهم بالخلايا المجاورة قد حصلوا على خصائص وظيفية مختلفة مما كانت أصلاً في فيفو. ل…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D8537	Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.
L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	L5520	Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).
NaOH	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5881	Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.
NaHCO3	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5761	10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.
D-mannitol	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	63565	Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.
D-glucose	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	G5400	4.5 mM  D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.
GlutaMAX Supplement	Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)	35050-061	Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.
Penicillin-Streptomycin	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	P0781	Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin).
Trypsin type II-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T7409	Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T6522	Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below).
Dnase I	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D5025	Use in trypsin inhibitor solution (see above).
0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system	Corning Inc. (Corning, NY)	431097	Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.
35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-10-C	Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11254-20	Straigt tip
Dumont #5/45 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11253-25	Angled 45° tip
Stereo microscope SZ61	Olympus Corp. (Tokyo, Japan)		Use for dissection of pituitaries.
Alegra X-22R Centrufuge	Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)		With cooling option (similar to current model XR-30).
Water bath	Techne (Staffordshire, UK)		Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.
Pasteur glass pipettes	VWR (NY)	612-1701	Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.
Galaxy MiniStar table centrifuge	VWR (NY)	521-2844	Any small table centrigue will do.
Fine needles / insect pins	Fine Science Tools (CA)	26001-40	Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.
Wax plate			Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.