Préparation d’une Culture de cellules primaires de haute qualité de poisson hypophyses

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour établir et maintenir des cultures primaires de cellules hypophysaires de medaka (Oryzias latipes). Les conditions optimisées dans le présent protocole compte paramètres importants tels que la température et l’osmolalité pH en imitant les conditions physiologiques du poisson, ce qui permet des résultats physiologiquement plus significatifs.

Résumé

Culture cellulaire primaire est un outil puissant couramment utilisé par les scientifiques pour étudier les propriétés cellulaires et les mécanismes des cellules isolées dans un environnement contrôlé. Malgré les grandes différences dans la physiologie entre les mammifères et les poissons, les protocoles de culture de cellules primaires de poissons reposent souvent sur des conditions de culture chez les mammifères, souvent avec des modifications mineures. Les différences environnementales affectent non seulement la température corporelle, mais aussi le sérum sanguin paramètres tels que l’osmolalité, du pH et pouvoir tampon pH. Comme milieux de culture cellulaire et des solutions de travail similaires sont censées imiter les caractéristiques du liquide extracellulaire et/ou sérum sanguin auquel une cellule est adaptée, il est crucial que ces paramètres soient adaptées spécifiquement à l’animal en question.

Le protocole actuel décrit les conditions de culture primaire optimisé pour medaka (Oryzias latipes). Le protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d’isoler et de maintenir en bonne santé dissocient des cellules hypophysaires pendant plus d’une semaine et comprend les étapes suivantes : 1. l’adaptation de l’osmolalité aux valeurs trouvées dans le plasma sanguin de medaka, 2. l’adaptation de la température d’incubation à température normale medaka (ici dans l’installation de l’aquarium) et 3. l’ajustement du pH et du bicarbonate tampon aux valeurs comparables à d’autres espèces de poissons vivant à des températures similaires. Les résultats présentés en utilisant le protocole décrit promouvoir physiologiquement significatives résulats médaka et peuvent être utilisés comme un guide de référence par les scientifiques faisant des cultures de cellules primaires des autres espèces non mammifères.

Introduction

Culture cellulaire est l’un des principaux outils utilisés dans la recherche en biologie moléculaire, grâce à un système excellent modèle pour répondre à des questions biologiques différentes allant de la physiologie cellulaire normale à drogues dépistage et carcinogenèse¹. Les cellules primaires, prélevés directement les tissus d’origine animale par des méthodes enzymatiques et/ou mécaniques, sont souvent considérés comme biologiquement plus pertinentes que les lignées cellulaires comme la réaction biologique peut se rapprocher de la situation in vivo . Protocoles pour la préparation de cultures de cellules primaires doivent être opti....

Protocole

L’expérimentation animale dans cette étude ont été approuvées par l’Université norvégienne de Sciences de la vie, les directives suivantes pour les soins et le bien-être des animaux de recherche.

1. préparation des Solutions

1. Étalonner les instruments d’osmomètre et pH mètre selon les instructions du fabricant pour assurer des mesures correctes.
2. Préparer 500 mL de Ca^{2 +}- et Mg^{2 +}-libre tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD), ajuster le pH à 7,75 (étape 1.2.1) et l’osmolalité à 290 mOsm/kg (étape 1.2.2) avant une filtration stérilisante (étape 1.2.3).
   1. Ajuster le pH à 7,75....

Résultats

Ce protocole décrit la préparation d’une culture de cellules primaires de glandes pituitaires médaka et fournit des cellules saines qui peuvent être maintenues dans une culture pendant au moins une semaine. Le protocole repose sur des valeurs pertinentes physiologiques pour le médaka¹⁴ et est en outre optimisé pour le tissu hypophysaire chez les poissons adultes, à l’aide d’un pH de 7,75 et une osmolalité de 290 mOsm/kg pendant toute la procédure de la récolte de t.......

Discussion

Systèmes de culture in vitro cell fournissent des outils puissants pour les chercheurs de répondre à une multitude de questions biologiques si utilisé dans le droit chemin¹. Il est important de se rappeler que les cellules dissociées qui ont perdu leurs connexions aux cellules voisines peuvent avoir obtenu des propriétés fonctionnelles différentes qu’ils avaient initialement in vivo. Pour éviter d’être au risque d’une mauvaise interprétation des résultats obtenus à partir des exp.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (dPBS), sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	D8537	Ajuster la solution à un pH de 7,75 avec 1M de NaOH et 290 mOsm avec du mannitol.
Milieu L-15 (Leibovitz), sans L-glutamine	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	L5520	Supplément 500 ml de milieu de culture avec 10 mM de NaHCO3, 4,5 mM de glucose, 2 mM de Glutamax. Ajuster la solution à 290 mOsm avec du mannitol et filtrer la solution à travers un 0,2 & micro ; Filtre stérile en PES, avant d’ajouter 2,5 mL de solution de pénicilline-streptomycine (voir ci-dessous pour plus de détails).
NaOH	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	S5881	Ajouter des gouttes de la solution 1 M pour augmenter le pH du dPBS et du milieu de culture à 7,75.
NaHCO3	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	S5761	10 mM de NaHCO3 équivaut à 420 mg par milieu de culture de 500 ml.
D-mannitol	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	63565	Utiliser pour augmenter l’osmolalité du dPBS et du milieu de culture. Calculez la quantité correcte nécessaire pour atteindre une osmolalité de 290 mOsm.
D-glucose	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	G5400	4,5 mM  ; Le D-glucose équivaut à 405 mg par milieu de culture de 500 ml.
Supplément GlutaMAX	Gibco (Life Technologies, Paisley, Royaume-Uni)	35050-061	Alternative à la L-glutamine, avec une stabilité accrue. 2 mM de Glutamax équivaut à 5 ml de 100x stock dans un milieu de culture de 500 mL.
Pénicilline-Streptomycine	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	P0781	Solution mère 10 000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine par ml. Utiliser 2,5 mL de solution mère dans un milieu L-15 de 500 mL (équivalent de 50 U/mL de pénicilline et de 50 µ ; g/mL de streptomycine).
Trypsine de type II-S	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	T7409	Préparer 1 mg/mL dans une solution de dPBS.
Inhibiteur de la trypsine de type I-S	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	T6522	Préparer 1 mg/mL dans une solution dPBS, compléter avec 2 µ ; g/ml Dnase I (voir détails ci-dessous).
Dnase I	Sigma (Merck, Damstadt, Allemagne)	D5025	Utilisation dans une solution d’inhibiteur de la trypsine (voir ci-dessus).
0,2 et micro ; m Système de filtration stérile en polyéthersulfone (PES)	Corning Inc. (Corning, NY)	431097	Utilisation pour la filtration stérile du milieu dPBS et L-15 après ajustements.
Boîte de culture cellulaire de 35 mm avec fond en verre, revêtement en polyd-lysine	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-10-C	Peut également être remplacée par une boîte en plastique, en fonction de l’application en aval.
Pince fine Dumont #5	Fine Science Tools (CA)	11254-20	Pointe droite
Pince fine Dumont #5/45	Fine Science Tools (CA)	11253-25	Pointe coudée 45° ;
Stéréomicroscope SZ61	Olympus Corp. (Tokyo, Japon)		À utiliser pour la dissection des hypophysaires.
Alegra X-22R Centrufuge	Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)		Avec option de refroidissement (similaire au modèle actuel XR-30).
Bain-marie	Techne (Staffordshire, Royaume-Uni)		N’importe quel bain d’eau avec la possibilité de régler la température fera l’affaire.
Pipettes en verre Pasteur	VWR (NY)	612-1701	Diamètre extérieur 1,6 mm, polissage au feu et autoclave avant utilisation.
Centrifugeuse de table Galaxy MiniStar	VWR (NY)	521-2844	N’importe quelle petite centrifugeuse de table fera l’affaire.
Aiguilles fines/épingles à insectes	Outils scientifiques fins (CA)	26001-40	Diamètre 0,03 mm. D’autres aiguilles fines peuvent être utilisées à la place.
Plaque			fabriquée sur mesure en ajoutant de la cire de paraffine fondue dans une grande boîte de Pétri.

de cire