Kvantifiera växt lösligt Protein och lättsmält kolhydrat innehåll, med hjälp av majs (Zea mays) som ett föredöme
Summary
De protokoll som beskrivs häri ger en tydlig och lättillgänglig metod för mätning av lösligt protein och lättsmält (icke-strukturella) kolhydratinnehållet i växt vävnader. Möjligheten att kvantifiera dessa två växt makronäringsämnen har betydande konsekvenser för framflyttning områdena växtfysiologi, näringsmässiga ekologi, växt-herbivor interaktioner och mat-web ekologi.
Abstract
Elementär data används ofta att härleda växt kvalitet som en resurs för växtätare. Men begränsa gränslösa av kol i biomolekyler, förekomsten av kvävehaltiga växt defensiva föreningar och variation i artspecifika korrelationer mellan kväve och växt proteinhalt alla riktigheten av dessa slutsatser. Dessutom forskning inriktad på anläggningen eller växtätare fysiologi kräver en nivå av noggrannhet som inte uppnås med generaliserad korrelationer. De metoder som presenteras här ger forskare en tydliga och snabba protokoll för direkt mätning av lösliga växtproteiner och lättsmälta kolhydrater, två växt makronäringsämnen mest nära knuten till djurens fysiologiska prestanda. Protokollen kombinera väl karakteriserade kolorimetriska analyser med optimerad anläggningsspecifika matsmältningen steg att ge exakta och reproducerbara resultat. Våra analyser av olika sockermajs vävnader visar att dessa analyser har känsligheten att upptäcka variation i växt lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll över flera rumsliga skalor. Dessa inkluderar mellan-växt skillnader över växande regioner och arter eller sorter, liksom inom-växt skillnader i vävnadstyp och även positionella skillnaderna inom samma vävnaden. Att kombinera lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll med elementärt data har också potential att ge nya möjligheter i växtbiologi ansluta Mineralisk växtnäring med växt fysiologiska processer. Dessa analyser hjälper också generera lösligt protein och lättsmält kolhydrat-data som behövs för att studera näringsmässiga ekologi, växt-herbivor interaktioner och näringsväv dynamik, som i sin tur kommer att förbättra fysiologi och ekologisk forskning.
Introduction
Växtbiomassa utgör grunden för nästan alla landlevande födovävar. Växter förvärva näringsämnen från marken genom sina rötter-system och utnyttja solljuset i sina foliar vävnader att syntetisera biomolekyler. I synnerhet kol och kväve används för att skapa kolhydrater, proteiner (som består av aminosyror) och lipider som behövs för att bygga anläggningen biomassa (det bör noteras att i växt fysiologi den termen ”macronutrient” ofta hänvisar till jord element, såsom N, P, K och S, men kommer i hela detta dokument denna term se biomolekyler, som proteiner, kolhydrater och lipider). När växtätare konsumerar växtmaterial, makronäringsämnen som finns i växt vävnader bryts ner i sina beståndsdelar och sedan används för att driva de fysiologiska processerna av konsumenten. På detta sätt har växt makronäringsämnen en stark påverkan på konsumenten fysiologi tillsammans med viktiga konsekvenser för högre ordning ekologiska interaktioner och mat-web dynamics.
Över hela djurriket är lösligt protein och smältbara kolhydrater makronäringsämnen mest nära knuten till överlevnad, reproduktion och prestanda1. Dessutom reglera majoriteten av djur aktivt sitt intag av makronäringsämnen två att möta deras fysiologiska krav1,2. Detta är särskilt sant för insekt växtätare som upptäcka koncentrationerna av sockerarter och aminosyror i växt vävnader, som i sin tur styr utfodring beteende. Som ett resultat, plantera lösligt protein och lättsmält kolhydratinnehållet har spelat en stor roll i utvecklingen av växt-insekt interaktioner.
Även uppgifter om anläggningen lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll är relativt sällsynta (men se6,7,8,9,10,11), finns det en övervikt av tillgängliga data om anläggningen elementärt innehåll (kol, kväve och fosfor). Till stor del detta beror på att elementen har en primär roll i växt Mineralisk näring3,4,5. Där element mäts, korrelationer har använts för att extrapolera mängden lösligt protein och lättsmälta kolhydrater, men exakta beräkningar är ofta svårt att få. Det är exempelvis omöjligt att använda kol som en indikator på anläggningen lättsmält kolhydratinnehållet eftersom kol finns ubiquitously i alla organiska föreningar. En starkare relation mellan elementärt kväve och växt lösligt proteininnehåll och generaliserad kväve-till-protein konverteringsfaktorer änvänds ofta. Det finns dock starka bevis för att kväve-till-protein konverteringar är mycket artspecifika12,13,14,15, gör användningen av generaliserad konvertering sannolikt felaktig. På grund av detta saknar kväve-till-protein konverteringsfaktorer ofta precision, särskilt i den utsträckning som krävs för näringsmässiga studier på växtätare. Dessutom kan förekomsten av N-innehållande växt allelochemicals, såsom alkaloider och Glukosinolater som ofta är giftiga för växtätare, blanda ihop dessa konverteringar.
Här erbjuder vi två kemiska analyser för att mäta koncentrationen av lösliga proteiner och smältbara kolhydrater i växt vävnader. Dessa analyser redovisas separat, men det föreslås att de användas samtidigt att analysera de samma växtprover för att uppnå en mer omfattande analys av växten makronäringsämnen. Båda använder liknande metoder, som består av en extraktion steg, följt av kvantifiering via absorbans. Anläggningen prov prep är också identiska för båda protokollen, vilket gör det enkelt att köra båda analyser i tandem. Nyttan av dessa analyser inte uppstår ur sin nyhet, eftersom de bygger på äldre, (Bradford, Jones, Dubois) väletablerade kolorimetriska analyser16,17,18, men här har vi organiserat en tydlig och lätt att följa protokoll som kombinerar dessa metoder med mer obskyra anläggningsspecifika utvinning tekniker17,19 för att göra tillämpningen av dessa analyser mer tillgängliga för de i växt-relevanta fält.
För båda analyser extraheras växt makronäringsämnen först fysiskt genom frysning, frystorkning och slipning växtmaterial. För lösligt protein analysen, ytterligare sker kemisk extraktion17,19 genom flera rundor av vortexa och värme prover i NaOH-lösning. Den välkända Bradford assay, utnyttja Coomassie brilliant blue G-250, används för att kvantifiera lösliga proteiner och polypeptider mellan 3,000-5,000 Dalton16,17. Denna analys har ett detektionsområde mellan 1-20 µg totalt proteiner per mikroplattan väl eller < 25 µg/mL, men inte inte mäta fria aminosyror. Steget utvinning av lättsmält kolhydrat analysen är baserad på metoden för utspädd syra av Smith et al. 20 och tillåter för isolering av lösliga sockerarter, stärkelse, och fructosan – men inte strukturella kolhydrater. En fenol-sulfuric syra kvantifiering metod tas från Dubois et al. 18 och mäter alla mono-, oligo- och polysackarider (samt metyl derivat). Denna analys är kunna kvantifiera specifika sockerarter, men här använder vi det som en indikator på totala lättsmält kolhydrat innehåll (se Smith et al. 20 för mer detaljerad analys). Tillsammans, mäta dessa analyser två makronäringsämnen som är starkt bundna för att plantera eco-fysiologi och växtätare prestanda, med viktiga uppgifter om resurs kvalitet vid basen av terrestrial näringsvävar. Presentera dessa protokoll främjar generering av växten macronutrient datamängder för att erhålla en mer grundlig förståelse av växtfysiologi, växtätare näringsmässiga ekologi och växt-herbivor interaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genom att kombinera väletablerade kolorimetriska analyser med effektiv anläggningsspecifika extraktion protokoll, erbjuda analyserna visade här en rimlig och noggrann metod för att mäta växt lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll. Våra resultat med majs som ett föredöme illustrerar hur dessa protokoll kan användas för att erhålla exakta mätningar över olika biologiskt relevanta rumsliga skalor. Till exempel kunde vi identifiera skillnader i växten lösligt protein och lättsmält kolhydrat in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tack vare alla våra samarbetspartners som har bistått med sockermajs fältet samlingar, inklusive Dominic Reisig och Dan Mott vid North Carolina State University, och Pat Porter vid Texas A & M University i Lubbock, TX. Tack till Fiona Clissold för att hjälpa till att optimera protokoll och ge redigeringar till detta manuskript. Detta arbete stöds delvis av Texas A & M C. Everette Rebeccas Fellowship (Institutionen för entomologi) och bioteknik Risk bedömning Grant programmet konkurrenskraftiga bevilja nr 2015-33522-24099 från US Department of Agriculture (tilldelas GAS och STB).
Materials
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
References
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. . The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. . Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. , (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. . Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
