Kvantificere plante opløseligt Protein og fordøjeligt kulhydrat indhold, ved hjælp af majs (Zea mays) som en eksemplarisk

Summary

De protokoller, der er beskrevet heri giver en klar og imødekommende metode til måling af opløseligt protein og fordøjelig (nonstrukturelle) kulhydratindhold i plantevæv. Evnen til at kvantificere disse to plante makronæringsstoffer har stor betydning for at fremme inden for plantefysiologi, ernæringsmæssige økologi, plante-Planteæder interaktioner og fødekæde økologi.

Abstract

Elementært data er almindeligt anvendt til at udlede plantekvaliteten som en ressource til planteædere. Men den store udbredelse af kulstof i biomolekyler, tilstedeværelsen af nitrogen-holdige plante defensive forbindelser og variation i artsspecifikke korrelationer mellem kvælstof og plante proteinindhold alle begrænse nøjagtigheden af disse slutninger. Derudover forskning fokuseret på plante og/eller Planteæder fysiologi kræver en grad af nøjagtighed, der ikke opnås ved hjælp af generelle sammenhænge. De metoder, der præsenteres her tilbyde forskere en klar og hurtig protokol til direkte måling af vegetabilske opløselige proteiner og fordøjelige kulhydrater, to plante makronæringsstoffer mest tæt knyttet til dyrs fysiologiske ydeevne. Protokollerne kombinere godt karakteriseret kolorimetriske assays med optimeret plante-specifikke fordøjelsen skridt til at give nøjagtige og reproducerbare resultater. Vores analyser af forskellige sukkermajs væv vise, at disse assays har følsomhed til at opdage variation i plante opløseligt protein og fordøjeligt kulhydratindhold på tværs af flere rumlige skalaer. Disse omfatter mellem plante forskelle på tværs af voksende regioner og plantearter eller sorter, såvel som inden for plante forskelle i vævstype og endda positionel forskelle inden for den samme væv. Kombinere opløseligt protein og fordøjeligt kulhydratindhold med elementært data har også potentiale til at skabe nye muligheder i Plantebiologi tilsluttes planteernæring mineral med plante fysiologiske processer. Disse analyser også medvirke til at skabe opløseligt protein og fordøjeligt kulhydrat data skulle studere ernæringsmæssige økologi, plante-Planteæder interaktioner og mad-web dynamik, som vil til gengæld øge fysiologi og økologisk forskning.

Introduction

Plantebiomasse udgør grundlaget for næsten alle terrestriske fødevarer-webs. Planter erhverve næringselementer fra jorden gennem deres rødder systemer og udnytte sollys i deres blade væv til at syntetisere biomolekyler. Især kulstof og nitrogen bruges til at oprette kulhydrater, proteiner (som består af aminosyrer), og lipider, der er nødvendige for at bygge plantebiomasse (det skal bemærkes at i plante fysiologi udtrykket “makronæringsstoffer” ofte refererer til jord elementer, såsom Nielsen, P, K og S, men i hele dette papir dette udtryk vil henvise til biomolekyler, såsom proteiner, kulhydrater og lipider). Når planteædere forbruge plantemateriale, er makronæringsstoffer indeholdt i plantevæv opdelt i deres bestanddele og derefter bruges til at drive de fysiologiske processer af forbrugeren. På denne måde har planten makronæringsstoffer en stærk indflydelse på forbrugernes fysiologi sammen med stor betydning for højere orden økologiske interaktioner og fødekæde dynamics.

På tværs af dyreriget er opløseligt protein og fordøjelig kulhydrater makronæringsstoffer mest tæt knyttet til overlevelse, formering og præstationer¹. Derudover regulere flertal af dyr aktivt deres indtag af disse to makronæringsstoffer til at opfylde deres fysiologiske krav^1,2. Dette er især sandt for insekt planteædere, der registrerer koncentrationerne af sukker og aminosyrer i plantevæv, som igen dirigerer fodring adfærd. Som et resultat, plante opløseligt protein og fordøjeligt kulhydratindhold har spillet en stor rolle i udviklingen af plante-insekt interaktioner.

Mens data på plante opløseligt protein og fordøjeligt kulhydratindhold er relativt sjældne (men se^{6,7,8,9,10,11}), er der en overvægt af data tilgængelige på anlægget elementært indhold (carbon, nitrogen og fosfor). I vid udstrækning dette er fordi elementer spiller en primær rolle i anlægget mineral ernæring^3,4,5. Hvor elementer er målt, korrelationer har været anvendt til at ekstrapolere mængden opløseligt protein og fordøjeligt kulhydrat, men nøjagtige beregninger er ofte vanskeligt at opnå. For eksempel, er det umuligt at anvende CO2 som en indikator for anlægget fordøjeligt kulhydratindhold, fordi kulstof allestedsnærværende findes i alle organiske forbindelser. En stærkere relation mellem elementært kvælstof og plante opløseligt proteinindhold, og generaliseret kvælstof til protein omregningsfaktorer udnyttes ofte. Der er imidlertid stærke beviser for, at kvælstof til protein konverteringer er meget artsspecifik^12,13,14,15, at gøre brug af generaliseret konvertering sandsynligvis unøjagtige. På grund af dette mangler kvælstof til protein omregningsfaktorer ofte præcision, især i det omfang, der kræves til ernæringsmæssige undersøgelser af planteædere. Også kan tilstedeværelsen af N-holdige plante jordmiljøet, alkaloider og glucosinolater, som ofte er giftige for planteædere, forvirre disse konverteringer.

Her tilbyder vi to kemiske assays til måling af koncentrationen af opløselige proteiner og fordøjelige kulhydrater i plantevæv. Disse assays landerisikovurderinger fremlægges separat, men det foreslås, at de anvendes samtidig til at analysere de samme plante prøver for at opnå en mere omfattende analyse af planten makronæringsstoffer. Begge anvender lignende metoder, bestående af en ekstraktionstrinet, efterfulgt af kvantificering via absorbans. Plante prøve prep er også ens for begge protokoller, hvilket gør det nemt at køre begge analyser i tandem. Nytten af disse assays ikke stammer fra deres nyhedsværdi, som de afhængige ældre, (Bradford, Jones, Dubois) veletablerede kolorimetriske assays^16,17,18, men her vi har arrangeret en tydelig og nem at følge protokol, der kombinerer disse metoder med mere obskure plante-specifikke udvinding teknikker^17,19 for at gøre anvendelsen af disse assays mere tilgængelige for dem på plante-relevante områder.

For begge assays, er plante makronæringsstoffer først udvundet fysisk ved frysning, lyophilizing og slibning af plantemateriale. For opløseligt protein assay, er yderligere kemisk ekstraktion gjort^17,19 gennem flere runder vortexing og varme prøver i NaOH opløsning. Den velkendte Bradford assay, udnytte Coomassie strålende blå G-250, bruges derefter til at kvantificere opløselige proteiner og polypeptider mellem 3.000-5.000 dalton^16,17. Denne analyse har et registreringsområde mellem 1-20 µg samlede proteiner per mikrotiterplade godt eller < 25 µg/mL, men ikke ikke foranstaltning frie aminosyrer. Ekstraktionstrinet af fordøjeligt kulhydrat analysen er baseret på den fortyndede syre metode til Smith et al. ²⁰ og giver mulighed for dyrkning af opløselige sukker, stivelse, og fructosan – men ikke strukturelle kulhydrater. En phenol-svovlsyre syre kvantificering metode er taget fra Dubois et al. ¹⁸ og måler alle mono-, oligo- og polysakkarider (samt methyl derivater). Denne analyse er stand til at kvantificere specifikke sukker, men her bruger vi det som en indikator for samlede fordøjeligt kulhydratindhold (Se Smith et al. ²⁰ for nærmere analyse). Sammen, måle disse assays to makronæringsstoffer, der er stærkt bundet til at plante øko-fysiologi og planteædere ydeevne, giver vigtige data på ressource kvalitet i bunden af terrestriske fødevarer-webs. Præsentere disse protokoller fremmer generation af plante makronæringsstoffer datasæt for at opnå en mere grundig forståelse for plantefysiologi, Planteæder ernæringsmæssige økologi og plante-Planteæder interaktioner.

Protocol

1. plantebeskyttelsesmidler indsamling og behandling Indsamle og behandle planten prøver Efter indsamling af planten prøver, flash-freeze prøver ved at dyppe plantemateriale til flydende kvælstof med pincet og opbevares ved-80 ° C. Hvis planten prøver indsamlet er for stor til flash-freeze, hurtigt cool prøverne bruge tøris og overførsel til en-80 ° C fryser så snart som muligt. Makronæringsstoffer indholdet af plantemateriale kan ændre efter væv er adskilt fra anlægget, så det er vigtig…

Representative Results

For at vise nytten af disse metoder, analyseret vi opløseligt protein og fordøjeligt kulhydratindhold af fire forskellige felt og sukkermajs væv, der tjener som særskilte potentielle ernæringsmæssige ressourcer for insekt planteædere. Vi indsamlede kornet fra tre landbrugsområder i USA (Minnesota, North Carolina og Texas), som omfatter fem forskellige sorter af sukkermajs (dvs. genotyper) og en række felt majs som en outgroup. Tabel 3 viser en oversigt o…

Discussion

Ved at kombinere veletablerede kolorimetriske assays med effektive anlæg-specifikke udvinding protokoller, give assays demonstreret her en rimelig og nøjagtig metode til måling af plante opløseligt protein og fordøjeligt kulhydratindhold. Vores resultater med majs som et eksempel illustrerer, hvordan disse protokoller kan bruges til at opnå præcise målinger på tværs af forskellige biologisk relevante rumlige skalaer. For eksempel, var vi i stand til at opdage forskelle i anlægget opløseligt protein og fordøj…

Materials

microplate reader (spectrophotometer)	Bio-Rad	Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate	Bio-Rad	#5000006	450mL