Kwantificeren van de Plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud, met behulp van maïs (Zea mays) als een Exemplar
Summary
De protocollen die hierin worden beschreven zorgen voor een heldere en toegankelijke methode voor het meten van oplosbare eiwitten en verteerbare (niet-structurele) koolhydraatgehalte in plantaardige weefsels. De mogelijkheid om te kwantificeren van deze twee plant macronutriënten heeft aanzienlijke gevolgen voor het bevorderen van het gebied van plantenfysiologie, nutritionele ecologie, plant-herbivoor interacties en voedselweb ecologie.
Abstract
Elementaire gegevens worden vaak gebruikt om te concluderen van kwaliteit van de plant als een hulpbron voor herbivoren. Echter, de alomtegenwoordigheid van koolstof in biomoleculen, de aanwezigheid van stikstof bevattende defensieve plantenstoffen en variatie in soortspecifieke correlaties tussen stikstof en plant eiwitgehalte alle beperken de nauwkeurigheid van deze gevolgtrekkingen. Daarnaast onderzoek gericht op de plant en/of herbivoor fysiologie vereisen een niveau van nauwkeurigheid dat gebeurt niet door middel van correlaties veralgemeend. De hier gepresenteerde methoden bieden onderzoekers een duidelijke en snelle protocol voor eiwithoudende gewassen oplosbaar en verteerbare koolhydraten, de twee plant macronutriënten meest nauw verbonden met de prestaties van de dieren fysiologische rechtstreeks te meten. De protocollen combineren goed gekarakteriseerd colorimetrische testen met geoptimaliseerde plant-specifieke spijsvertering stappen om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te leveren. Onze analyses van verschillende weefsels tonen aan dat deze testen de gevoeligheid hebben voor variatie in detecteren suikermaïs planten oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud over meerdere ruimtelijke schalen. Deze verschillen tussen-plant toe te voegen in het groeiende regio’s en plantensoorten of rassen, evenals binnen-plant verschillen in weefseltype en zelfs positioneel binnen de dezelfde weefsel. Oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten inhoud combineren met elementaire gegevens heeft ook het potentieel te bieden van nieuwe kansen in plantenbiologie aansluiten minerale voeding van planten met plant-fysiologische processen. Deze analyses ook helpen bij het genereren van de oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten gegevens die nodig zijn voor het bestuderen van voeding ecologie, plant-herbivoor interacties en voedselweb dynamiek, die op zijn beurt fysiologie en ecologisch onderzoek zal versterken.
Introduction
Plantaardige biomassa vormt de basis van vrijwel alle terrestrische levensmiddelen-webs. Planten verwerven nutritionele elementen uit de grond via hun wortels systemen en gebruik maken van zonlicht in hun naalden weefsels voor het synthetiseren van biomoleculen. In het bijzonder koolstof en stikstof worden gebruikt voor het maken van koolhydraten, eiwitten (samengesteld uit aminozuren), en lipiden die nodig zijn om te bouwen plantaardige biomassa (hierbij moet worden opgemerkt dat in fysiologie plant, die de term “macronutriënten” vaak naar bodem elementen, zoals N verwijst, P, K en S, echter in heel dit papier deze term zal verwijzen naar biomoleculen, zoals eiwitten, koolhydraten en vetten). Als herbivoren plantmateriaal verbruiken, zijn de macronutriënten vervat in plantaardige weefsels opgesplitst in de samenstellende delen en vervolgens gebruikt om te rijden de fysiologische processen van de consument. Op deze manier hebben plant macronutriënten een sterke invloed op de consument fysiologie samen met belangrijke gevolgen voor hogere orde ecologische interacties en voedselweb dynamiek.
In het dierenrijk zijn oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten de macronutriënten meest nauw verbonden is met overleving, reproductie en prestaties1. De meerderheid van dieren regelen bovendien actief hun inname van deze twee macronutriënten aan hun fysiologische eisen1,2. Dit geldt met name voor insect planteneters die detecteren van de concentraties van suikers en aminozuren in plantaardige weefsels, die op zijn beurt voeding gedrag leidt. Dientengevolge, plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud heeft een sterke rol gespeeld in de evolutie van plant-insect interacties.
Hoewel gegevens over oplosbare plantaardige eiwitten en gehalte aan verteerbare koolhydraten relatief zeldzaam zijn (maar Zie6,7,8,9,10,11), is er een overwicht van beschikbare gegevens over plant elemental inhoud (koolstof, stikstof en fosfor). Grotendeels immers elementen spelen een hoofdrol in de plant minerale voeding3,4,5. Wanneer elementen worden gemeten, correlaties zijn gebruikt om de hoeveelheid oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten extrapoleren, maar nauwkeurige berekeningen zijn vaak moeilijk te verkrijgen. Bijvoorbeeld, is het onmogelijk om te gebruiken koolstof als een indicator van het gehalte aan plantaardige verteerbare koolhydraten omdat koolstof overal aanwezig in alle organische stoffen is. Een sterkere relatie bestaat tussen elementaire stikstof en plant oplosbaar eiwitgehalte en gegeneraliseerde stikstof-naar-eiwit omrekeningsfactoren worden vaak gebruikt. Echter, er zijn sterke aanwijzingen dat stikstof-naar-eiwit conversies zeer soortspecifieke12,13,14,15 zijn, waardoor het gebruik van veralgemeende omschakeling waarschijnlijk onjuist. Vanwege dit, stikstof-naar-eiwit conversiefactoren vaak geen precisie, met name in de mate die nodig is voor voeding studies over herbivoren. Ook de aanwezigheid van N-bevattende plant allelochemische stoffen, zoals alkaloïden en glucosinolaten die vaak giftig voor herbivoren zijn, kan het verwarren van deze conversies.
Hier bieden we twee chemische testen voor het meten van de concentratie voor oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten in plantaardige weefsels. Deze testen afzonderlijk worden gepresenteerd, maar er wordt voorgesteld dat zij worden gelijktijdig worden gebruikt voor het analyseren van de dezelfde plant monsters met het oog op een meer uitgebreide analyse van plantaardige macronutriënten. Beide vergelijkbaar methodologieën, bestaande uit een extractie stap, gevolgd door kwantificering via absorptie in dienst. Plant monster prep is ook identiek voor beide protocollen, zodat u gemakkelijk zowel analyse parallel lopen. Het nut van deze testen niet afkomstig zijn van hun nieuwheid, aangezien ze vertrouwen op oudere, (Bradford, Jones, Dubois) gevestigde colorimetrische assays16,17,18, maar hier organiseerden we hebben een duidelijke en gemakkelijk-aan-volgen Dit protocol deze methoden met meer obscure plant-specifieke extractie technieken-17,19 combineert de toepassing van deze tests meer om toegankelijk te maken voor degenen in de plant-relevante velden.
Voor beide tests, plant macronutriënten eerst fysiek uitgepakt door bevriezing, lyofilisering en slijpen van het plantmateriaal. Voor de oplosbaar eiwit assay, verder chemische extractie gebeurt17,,19 door verscheidene rondes van vortexing en verwarming monsters in NaOH oplossing. De bekende analyse van Bradford, gebruik makend van Coomassie briljant blauw G-250, wordt vervolgens gebruikt om te kwantificeren oplosbare eiwitten en polypeptiden tussen 3000-5000 Dalton16,17. Deze bepaling heeft een detectiebereik tussen 1-20 µg totale eiwitten per microplate goed of < 25 µg/mL, maar doet niet maatregel vrije aminozuren. De stap van de extractie van de verteerbare koolhydraten test is gebaseerd op de verdund zuur methode van Smith et al. 20 en zorgt voor de isolatie van oplosbare suikers, zetmeel, en fructosan – maar niet structurele koolhydraten. Een fenol-zwavelzuur zuur kwantificering methode is ontleend aan Dubois et al. 18 en de maatregelen van alle mono-, oligo-, en polysacchariden (evenals methyl derivaten). Deze test is kunnen kwantificeren van bepaalde suikers, maar hier gebruiken we het als een indicator van het gehalte aan totaal verteerbare koolhydraten (Smith et al. Zie 20 voor meer gedetailleerde analyse). Deze tests meten samen, de twee macronutriënten die sterk verbonden zijn plantenziekterisico eco-fysiologie en herbivoor prestaties, met belangrijke gegevens over de kwaliteit van de resource aan de basis van terrestrische levensmiddelen-webs. Presentatie van deze protocollen bevordert de generatie van plant macronutriënten datasets om een grondiger inzicht in plantenfysiologie, herbivoor voeding ecologie en plant-herbivoor interacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Door het combineren van gevestigde colorimetrische testen met protocollen van de extractie van effectieve plant-specifieke, bieden de testen hier aangetoond een redelijke en nauwkeurige methode voor het meten van de plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud. Onze resultaten met behulp van maïs zoals een voorbeeld hoe deze protocollen kunnen worden gebruikt illustreert voor het verkrijgen van nauwkeurige metingen over verschillende biologisch relevante ruimtelijke schalen. Bijvoorbeeld, waren wij kundig vo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dank aan allen van onze medewerkers die hebben geholpen met zoete maïs veld collecties, met inbegrip van Dominic Reisig en Dan Mott op North Carolina State University, en Pat Porter in Texas A & M University in Lubbock, TX. Dank aan Fiona Clissold voor zijn bijdrage aan het optimaliseren van de protocollen en wijzigingen in dit manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Texas A & M C. Everette Salyer Fellowship (departement van Entomologie) en de biotechnologie Risk Assessment Grant Program concurrerende verlenen nr. 2015-33522-24099 uit de U.S. Department of Agriculture (toegekend aan GAS en STB).
Materials
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
References
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. . The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. . Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. , (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. . Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
