Quantifizierung der Pflanze lösliche Protein und verdauliche Kohlenhydrate Inhalt, Verwendung von Mais (Zea Mays) als ein Exemplar
Summary
Die hier beschriebenen Protokolle liefern eine klare und ansprechbar Methodik zur Messung der lösliche Protein und verdaulich (nicht tragende) Kohlenhydratgehalt in Pflanzengeweben. Die Fähigkeit, diese zwei Pflanze Makronährstoffe quantifizieren hat erhebliche Auswirkungen für die Förderung der Felder der Pflanzenphysiologie, ernährungsphysiologischen Ökologie, Pflanze-Pflanzenfresser Interaktionen und Nahrungsnetz Ökologie.
Abstract
Elementare Daten werden häufig verwendet, Qualität der Pflanze als eine Ressource für Pflanzenfresser abzuleiten. Die Allgegenwart des Kohlenstoffs in Biomolekülen, die Anwesenheit von Stickstoff-haltigen defensive Pflanzenstoffe und Variation in artspezifische Korrelationen zwischen Stickstoff und pflanzlichen Eiweißgehalt alle schränken jedoch die Genauigkeit der diese Rückschlüsse. Darüber hinaus Forschung konzentriert sich auf Anlage und/oder Pflanzenfresser Physiologie erfordern ein Maß an Genauigkeit, die nicht erreicht wird mit Korrelationen verallgemeinert. Die hier vorgestellten Methoden bieten Forscher eine klare und schnelle Protokoll für lösliche Pflanzenproteine und verdauliche Kohlenhydrate, die zwei Pflanze Makronährstoffe meist eng mit physiologischen Tierleistung direkt zu messen. Die Protokolle kombinieren gut charakterisierten farbmetrischen Assays mit optimierten anlagenspezifischen Verdauung Schritten präzise und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Unsere Analysen der verschiedenen Zuckermais Gewebe zeigen, dass diese Tests die Sensibilität haben zu erkennen Variation in Pflanzen lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten in mehreren räumlichen Skalen. Diese Unterschiede zwischen Pflanze über wachsende Regionen und Pflanzenarten oder Sorten gehören, ebenso wie in-Pflanze in Gewebetyp und sogar positionellen Unterschiede innerhalb der gleichen Gewebe. Kombination von löslichen Proteinen und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten mit elementaren Daten hat auch das Potenzial, neue Möglichkeiten in Pflanzenbiologie, mineralischen Pflanzenernährung mit physiologischen Anlagenprozesse zu verbinden. Diese Analysen helfen auch generieren die lösliche Protein und verdaulichen Kohlenhydraten Daten musste studieren ernährungsphysiologischen Ökologie, Pflanze-Pflanzenfresser Interaktionen und Nahrungsnetz Dynamik, die wiederum Physiologie und ökologische Forschung gestärkt werden.
Introduction
Pflanzlicher Biomasse bildet die Grundlage für praktisch alle terrestrischen Nahrungsketten. Pflanzen Nährstoffe aus dem Boden über ihre Wurzeln zu erwerben und nutzen Sonnenlicht in ihrem Blatt-Gewebe Biomoleküle zu synthetisieren. Vor allem Kohlenstoff und Stickstoff werden verwendet, um Kohlenhydrate, Proteine (bestehend aus Aminosäuren) zu erstellen, und Lipide, die erforderlich sind, bauen pflanzlicher Biomasse (es sei darauf hingewiesen, dass in Pflanzen Physiologie bezieht sich der Begriff “Makronährstoffs” oft auf Boden-Elemente, z. B. N, P, K und S, jedoch verweisen in diesem Artikel der Begriff Biomoleküle wie Proteine, Kohlenhydrate und Lipide auf). Als Pflanzenfresser Pflanzenmaterial verbrauchen, sind die Makronährstoffe in Pflanzengewebe enthalten in ihre Bestandteile zerlegt und dann verwendet, um die physiologischen Prozesse des Verbrauchers zu fahren. Auf diese Weise haben Pflanze Makronährstoffe einen starken Einfluss auf Verbraucher Physiologie sowie wichtige Implikationen für höhere Ordnung ökologische Wechselwirkungen und Nahrungsnetz Dynamik.
Über das Tierreich sind lösliche Protein und verdauliche Kohlenhydrate die Makronährstoffe, die am ehesten zu überleben, Fortpflanzung und Leistung1gebunden. Darüber hinaus Regeln die Mehrzahl der Tiere aktiv ihre Einnahme von diesen beiden Makronährstoffe kennenlernen ihrer physiologischen Anforderungen1,2. Dies gilt insbesondere für Insekten Pflanzenfresser, die erkennen, die Konzentration von Zucker und Aminosäuren in Pflanzengeweben, die wiederum Fressverhalten leitet. Infolgedessen Pflanze lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten hat eine starke Rolle in der Evolution von Pflanzen-Insekten-Interaktionen.
Während Daten zur Anlage lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten relativ selten sind (aber siehe6,7,8,9,10,11), gibt es ein Übergewicht von Daten zur Anlage elementare Inhalte (Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor). Vor allem deshalb, weil Elemente eine wichtige Rolle im Werk Mineralnährstoffe3,4,5 spielen. Wo Elemente gemessen werden, Zusammenhänge wurden verwendet, um die Menge an löslichen Protein und verdauliche Kohlenhydrate zu extrapolieren, aber genaue Berechnungen sind oft schwer zu bekommen. Beispielsweise ist es unmöglich, Kohlenstoff als Indikator Pflanze verdauliche Kohlenhydrate Inhalte zu verwenden, da Kohlenstoff in alle organischen Verbindungen ubiquitär vorhanden ist. Eine stärkere Beziehung besteht zwischen elementaren Stickstoff und Pflanze lösliche Protein-Inhalt, und generalisierte Stickstoff-Protein Umrechnungsfaktoren werden häufig genutzt. Allerdings gibt es starke Hinweise, dass Stickstoff-Protein Konvertierungen höchst artspezifische12,13,14,15 sind, Nutzung der generalisierten Umwandlung wahrscheinlich ungenau. Aus diesem Grund ungenau Stickstoff-Protein Umrechnungsfaktoren oft, besonders in dem Maße, die für Ernährungsstudien an Pflanzenfresser erforderlich ist. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von N-haltigen Pflanzen allelochemischer, z. B. Alkaloide und glucosinolate, die oft giftig für Pflanzenfresser, sind diese Konvertierungen verwechseln.
Hier bieten wir zwei chemische Tests zur Messung der Konzentration von löslichen Proteinen und verdauliche Kohlenhydrate in pflanzlichen Geweben. Diese Tests werden separat vorgestellt, aber es wird empfohlen, dass sie gleichzeitig verwendet werden, die gleichen Pflanzenproben zu analysieren um eine umfassendere Analyse der Pflanze Makronährstoffe zu erreichen. Beide beschäftigen ähnliche Methoden, d. h. eine Extraktion, gefolgt von Quantifizierung über Absorption. Pflanze Probe Prep ist auch identisch für beide Protokolle, macht es einfach, beide Analysen parallel laufen. Das Dienstprogramm diese Assays nicht ergeben sich aus ihre Neuheit, da sie sich auf ältere, verlassen (Bradford, Jones, Dubois) etablierte farbmetrischen Assays16,17,18, aber hier organisierten wir eine klare und leicht verständliche Protokoll, das diese Methoden eher obskuren anlagenspezifischen Extraktion Techniken17,19 kombiniert, um die Anwendung dieser Assays für diejenigen in Anlage-relevanten Bereichen besser zugänglich zu machen.
Für beide Assays werden Pflanze Makronährstoffe zuerst körperlich durch Einfrieren, Lyophilisation und Schleifen das Pflanzenmaterial extrahiert. Die lösliche Protein Assay weitere chemische Extraktion17,19 durch mehrere Runden von aufschütteln und Heizung Proben in NaOH Lösung erfolgt. Bekannten Bradford-Test, Verwendung von Coomassie brilliant blue G-250, wird dann verwendet, um lösliche Proteine und Polypeptide zwischen 3.000-5.000 Dalton16,17zu quantifizieren. Dieser Test hat eine Reichweite zwischen 1-20 µg Gesamt Protein pro Mikrotestplatte gut oder < 25 µg/mL, aber tut nicht Maßnahme Freie Aminosäuren. Extraktionsschritt verdauliche Kohlenhydrate Assay basiert auf die verdünnte Säure Methode von Smith Et al. 20 und die Isolation der lösliche Zucker, Stärke, und Fructosan – aber nicht strukturelle Kohlenhydrate erlaubt. Ein Phenol-schweflige Säure Quantifizierungsmethode stammt von Dubois Et al. 18 und misst alle Mono-, Oligo-Polysaccharide (sowie und Methyl-Derivate). Dieser Test ist in der Lage, bestimmte Zucker zu quantifizieren, aber hier benutzen wir es als Indikator für den Gehalt an Gesamt verdaulichen Kohlenhydraten (siehe Smith Et Al. 20 für eine detailliertere Analyse). Diese Tests messen zusammen, die beiden Makronährstoffe, die stark gebunden sind, um Öko-Physiologie Pflanzenfresser, Leistungsfähigkeit sowie die Bereitstellung von wichtiger Daten auf Ressource Qualität an der Basis der terrestrischen Nahrungsketten zu Pflanzen. Präsentiert diese Protokolle fördert die Generation der Pflanze Makronährstoff-Datasets, um eine tiefer gehende Verständnis der Pflanzenphysiologie, Herbivore Ernährung Ökologie und Pflanze-Pflanzenfresser Interaktionen zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durch die Kombination von etablierten farbmetrischen Assays mit effektive Absaugung der anlagenspezifischen Protokolle, bieten die Assays zeigte hier eine vernünftigste und präzise Methode zur Messung der Pflanze lösliche Protein und Gehalt an verdaulichen Kohlenhydraten. Unsere Ergebnisse mit Mais als ein Musterbeispiel wie diese Protokolle verwendet werden können veranschaulicht, um präzise Messungen in verschiedenen biologisch relevanten räumlichen Skalen zu erhalten. Zum Beispiel konnten wir Unterschiede in lö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vielen Dank an alle unsere Mitarbeiter, die mit Mais Feld Sammlungen unterstützt haben, einschließlich Dominic Reisig und Dan Mott an der North Carolina State University und Pat Porter an der Texas A & M University in Lubbock, TX. Vielen Dank an Fiona Clissold für die Hilfe, die Protokolle zu optimieren und für die Bereitstellung von Änderungen an dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der Texas A & M C. Everette Salyer Fellowship (Abteilung von Entomologie) und der Biotechnologie Risiko Assessment Grant Program wettbewerbsfähig gewähren Nr. 2015-33522-24099 vom US Department of Agriculture (verliehen an GAS und STB).
Materials
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
References
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. . The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. . Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. , (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. . Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
