Kvantifisere anlegget løselig Protein og fordøyelige karbohydrater innhold, bruke korn (Zea mays) som en Exemplar
Summary
Protokollene beskrevet her gi en klar og imøtekommende metodikk for måling av løselig protein og fordøyelig (ikke-strukturell) karbohydratholdige innhold i anlegget vev. Evne å kvantifisere disse to plante makronæringsstoffer har viktige implikasjoner for fremme Fræna, ernæringsmessige økologi, plante-herbivore interaksjoner og mat-web økologi.
Abstract
Grunnleggende data brukes vanligvis til å antyde plante kvalitet som en ressurs planteetere. Men begrense ubiquity av karbon i biomolecules, nitrogen-inneholdende anlegget defensive forbindelser, og variasjon i artsspesifikke sammenhenger mellom nitrogen og plante proteininnhold alle nøyaktigheten av disse slutninger. I tillegg forskning fokusert på anlegget og herbivore fysiologi et nivå av nøyaktighet som ikke oppnås bruker generalisert sammenhenger. Metodene presenteres her tilbyr forskere en klar og rask protokoll for direkte måling anlegget løselig proteiner og fordøyelige karbohydrater, to plante makronæringsstoffer tettest knyttet til dyr fysiologiske ytelse. Protokollene kombinerer godt preget kolorimetrisk analyser med optimalisert plante-spesifikke fordøyelsen slik gir presis og reproduserbar resultater. Våre analyser av ulike sukkermais vev viser at disse analyser har følsomheten å oppdage variasjon i plante løselig protein og fordøyelig karbohydratholdige innhold over flere romlige skalaer. Disse inkluderer mellom anlegget forskjeller over voksende regioner og plantearter eller varianter, samt i anlegget forskjeller i vev type og med posisjonelle forskjeller innenfor samme vev. Kombinere løselig protein og fordøyelig karbohydratholdige innhold med grunnleggende data har potensial til å gi nye muligheter i plant biology koble mineral plantenæring med anlegget fysiologiske prosesser. Disse analysene også hjelpe generere løselig protein og fordøyelige karbohydrater dataene for å studere ernæringsmessige økologi, plante-herbivore samhandlinger og mat-web dynamikk, som igjen vil forbedre fysiologi og økologiske forskning.
Introduction
Anlegget biomasse danner grunnlaget for nesten alle terrestriske næringskjeder. Planter erverve ernæringsmessige elementene fra jorden gjennom sine røtter systemer og bruker sollys av foliar vev å syntetisere biomolecules. Spesielt karbon- og nitrogen brukes til å opprette karbohydrater, proteiner (består av aminosyrer) og lipider som trengs for å bygge anlegg biomasse (det bør bemerkes at i plante fysiologi begrepet “macronutrient” refererer ofte til jord elementer, for eksempel N, P, K og S, men vil i hele dette papiret termen referere til biomolecules, som proteiner, karbohydrater og lipider). Når planteetere forbruke plantemateriale, er makronæringsstoffer i anlegget vev brutt ned i sine bestanddeler og deretter brukes til å drive de fysiologiske prosessene hos forbrukeren. Dette har anlegget makronæringsstoffer en sterk innflytelse på forbruker fysiologi sammen med viktige implikasjoner for høyere orden økologiske interaksjoner og næringskjeden dynamics.
Over dyreriket er løselig protein og fordøyelige karbohydrater makronæringsstoffer tettest knyttet til overlevelse og reproduksjon ytelse1. Videre regulere fleste dyr aktivt inntak av disse to makronæringsstoffer å møte sine fysiologiske behov1,2. Dette gjelder særlig for insekt planteetere som oppdager konsentrasjonen av sukker og aminosyrer i anlegget vev, som i sin tur leder fôring atferd. Resultatet anlegg løselig protein og fordøyelig karbohydratholdige innhold har spilt en sterk rolle i utviklingen av plante-insekt interaksjoner.
Mens data på anlegget løselig protein og fordøyelig karbohydratholdige innhold er relativt sjeldne (men se6,,7,,8,,9,,10,,11), er det en overvekt av data tilgjengelig på anlegget elementært innhold (karbon, nitrogen og fosfor). Hovedsak dette er fordi elementene spiller en primær rolle i anlegget mineral ernæring3,4,5. Der elementene er målt, sammenhenger har blitt benyttet for å ekstrapolere løselig protein og fordøyelige karbohydrater, men nøyaktige beregninger er ofte vanskelig å få. For eksempel, er det umulig å bruke karbon som en indikator på anlegget fordøyelig karbohydratholdige innhold fordi karbon finnes overalt i alle organiske forbindelser. Et sterkere forhold eksisterer mellom grunnleggende nitrogen og plante løselig proteininnhold, og generalisert nitrogen-til-protein omregningsfaktorer benyttes ofte. Men er det sterke bevis for at nitrogen-til-protein konverteringer er svært artsspesifikke12,13,14,15, gjør bruk av generalisert konvertering sikkert unøyaktig. Derfor mangler nitrogen-til-protein omregningsfaktorer ofte presisjon, spesielt i den grad som kreves for ernæringsmessige studier på planteetere. Også kan tilstedeværelsen av N inneholder anlegget allelochemicals, som alkaloider og glukosinolater som er ofte giftige for planteetere, forvirre konverteringene.
Her tilbyr vi to kjemiske analyser for måling av konsentrasjonen av løselig proteiner og fordøyelige karbohydrater i anlegget vev. Disse analyser presenteres separat, men det anbefales at de brukes samtidig å analysere samme plante prøvene for å oppnå en mer omfattende analyse av anlegget makronæringsstoffer. Begge benytter samme metoder, som består av en utvinning trinn, etterfulgt av kvantifisering via absorbance. Anlegget eksempel prep er også like for begge protokollene, gjør det enkelt å kjøre begge analyser i tandem. Nytten av disse analyser ikke stammer fra deres nyhet, som de stole på eldre (Bradford, Jones, Dubois) veletablerte kolorimetrisk analyser16,17,18, men her vi har organisert en tydelig og lett å følge protokoll som kombinerer disse metodene med mer obskure plante-spesifikke utvinning teknikker17,19 for å gjøre bruk av disse analyser mer tilgjengelig for de i anlegget relevante felt.
For begge analyser trekkes plante makronæringsstoffer først fysisk frysing, lyophilizing og sliping plantemateriale. Løselig protein analysen, ytterligere gjøres kjemiske utvinning17,19 gjennom flere runder med vortexing og oppvarming prøver NaOH løsning. Kjente Bradford analysen, utnytte Coomassie briljant blå G-250, brukes deretter å kvantifisere løselig proteiner og polypeptides mellom 3,000-5,000 Daltons16,17. Denne analysen har en rekkevidde mellom 1-20 µg totale proteiner per microplate godt eller < 25 µg/mL, men har ikke måle gratis aminosyrer. Utvinning trinn i fordøyelige karbohydrater analysen er basert på fortynne syre metoden for Smith et al. 20 og isolasjon av løselig sukker, stivelse, og fructosan- men ikke strukturelle karbohydrater. Fenol-sulfuric syre kvantifisering metode er tatt fra Dubois et al. 18 og måler alle mono-, oligo-, og polysakkarider (samt metyl derivater). Denne analysen er kunne kvantifisere bestemt sukker, men her vi bruke det som en indikator på totalt fordøyelig karbohydratholdige innhold (se Smith et al. 20 for mer detaljert analyse). Sammen måle disse analyser to makronæringsstoffer som er sterkt knyttet til plante øko-fysiologi og herbivore ytelse, gir viktige data om ressurskvalitet ved foten av terrestriske næringskjeder. Presentere disse protokollene fremmer generering av anlegget macronutrient datasett for å få en mer grundig forståelse av Fræna herbivore ernæringsmessige økologi og plante-herbivore interaksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved å kombinere veletablerte kolorimetrisk analyser med effektiv plante-spesifikke utvinning protokoller, gi analyser demonstrert her en rimelig og nøyaktig metode for å måle anlegget løselig protein og fordøyelig karbohydratholdige innhold. Våre resultater med mais som et eksemplar illustrerer hvordan disse protokollene kan brukes å få nøyaktige mål på tvers av forskjellige biologisk relevante romlige skalaer. For eksempel kunne vi oppdage forskjeller i anlegget løselig protein og fordøyelig karbohydrathol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Takk til alle våre samarbeidspartnere som har bidratt med sukkermais feltsamlinger, inkludert Dominic Reisig og Dan Mott ved North Carolina State University og Pat Porter ved Texas A & M University i Lubbock, TX. Takk til Fiona Clissold for å optimalisere protokollene og for endringer i dette manuskriptet. Dette arbeidet var støttes delvis av Texas A & M C. Everette Salyer fellesskap (avdeling av entomologi) og bioteknologi risiko vurdering Grant Program konkurransedyktig gi nr 2015-33522-24099 fra det amerikanske Department of Agriculture (til gass og STB).
Materials
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
References
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. . The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , (2012).
- Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
- Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
- Chapin, F. S. The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
- Marschner, H. . Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants. , (1956).
- Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
- Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
- Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
- Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
- Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
- Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
- Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. 78, 105-109 (2002).
- Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
- Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
- Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
- Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
- Cui, S. W. . Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , (2005).
- Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
- Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
- Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
- Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
- Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
- Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
- Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
- Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
- Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).
