Kvantitativ PCR af T7 Bacteriophage fra Biopanning
Summary
En reproducerbar, præcis og tid effektiv kvantitativ PCR (qPCR) metode til at optælle T7 bacteriophage er beskrevet her. Protokollen beskriver klart phage genomisk DNA forberedelse, PCR reaktion forberedelse, qPCR cykling betingelser og qPCR dataanalyse.
Abstract
Denne protokol beskriver brugen af kvantitativ PCR (qPCR) til at optælle T7 phages fra phage udvalg eksperimenter (dvs., “biopanning”). qPCR er et fluorescens-baseret tilgang til at kvantificere DNA, og her, det er tilpasset til at kvantificere phage genomer som en proxy for phage partikler. I denne protokol, er præparationsmetode facile phage DNA beskrevet ved hjælp af høj temperatur varme uden ekstra DNA oprensning. Metoden bør kun små mængder af varmebehandlet phages og små mængder af qPCR reaktion. qPCR er høj overførselshastighed og hurtigt, stand til at behandle og få data fra en 96-brønd plade af reaktioner i 2 – 4 h. i forhold til andre phage optælling tilgange, qPCR er mere tid-effektive. Her, bruges qPCR til at optælle T7 phages identificeret fra biopanning mod in vitro- cystisk fibrose-lignende Slim model. Metoden qPCR kan udvides til at kvantificere T7 phages fra andre eksperimenter, herunder andre typer af biopanning (fx., immobiliserede protein binding, in vivo phage screening) og andre kilder (f.eks. vandsystemer eller kropsvæsker). I Resumé, kan denne protokol ændres til at kvantificere alle DNA-indkapslede vira.
Introduction
Bacteriophage (phage) display teknologi, udviklet af George Smith i 1985, er en kraftfuld, høj overførselshastighed tilgang til at identificere peptid eller protein ligander mod mål eller receptorer fra cellemembranen, sygdom antigener, cellulære organeller eller specifikke organer og væv i de sidste to årtier1,2. Her, tilfældige biblioteker af polypeptider eller enkelt kæde antistoffer vises på coat proteiner af phages (typisk M13 eller T7), og specifikke ligander kan identificeres fra panorering mod immobiliseret proteiner i in vitro eller in vivo biologiske systemer gennem en iterativ udvælgelsesproces. Ligander kan derefter kobles til billedbehandling eller terapeutiske agenter for diagnose og behandling af sygdomme3,4. Det er afgørende at præcist optælle phages under flere trin i biopanning: (1) til at kvantificere phages, der binder til underlaget og (2) kvantificere phages for at afgøre, om der er berigelse med hver runde af valg (phage berigelse angiver biopanned Phage affinitet for målet). Den nuværende guld standard for kvantificering, dobbelt-lag plak assay, præsenterer flere udfordringer; Det er kedelig, besværlig og potentielt unøjagtige for et stort antal prøver. Vores gruppe har derfor udviklet en følsom, reproducerbar, præcise og tid-effektive kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) metode til at optælle M13 og T7 phage partikler fra biopanning5.
qPCR er en attraktiv og realistisk metode til nøjagtigt kvantificere T7 og M13 phages. Da hver enkelte phage partikel kan kun indeholde én kopi af genomisk DNA (dsDNA eller ssDNA), er en phage genom svarende til én phage partikel; af kvantificerer antallet af phage genomer, er det muligt at opgøre antallet af phages. Under qPCR, fluorescerende reporter farvestoffer binde phage genomisk DNA ikke-specifikt eller specifikt gennem sekvens-specifikke primere under PCR-amplifikation og fluorescens signal stiger med hver runde af forstærkning. Når fluorescens signal når den tærskel, som runde/cyklus af forstærkning er noteret som tærskel cyklus (Ct). De kendte koncentrationer af reference phage DNA plottes mod deres Ct værdier til at etablere en standardkurve. Du bruger standardkurven med Ct-værdier af DNA-prøver, kan koncentrationen af phages indskydes.
Mens mange strategier har været tidligere udviklet og flittigt brugt til at kvantificere phages fra biopanning, har hver af dem specifikke udfordringer. Den mest populære og konventionelle metode er dobbelt-lag plak assay. Her, vært bakterier er smittet med phages forberedt på serielle fortyndinger, er belagt på en solid agar-substrat, og er belagt med agar; phages er opregnet med antallet af plaques dannet (dvs. plak-dannende enheder eller pfu) på agar plade. Plaque assay er følsomme, men kedelig, tidskrævende og unøjagtige, især for mange prøver og med høje koncentrationer5. Derudover er enzymmaerket assays (ELISA) blevet tilpasset til at optælle M13 og T7 phage partikler6,7,8. Her, phages på forskellige fortyndinger er bundet og fanget på et solidt underlag (dvs. en mikrotiterplade), aftestede med phage-specifikke antistoffer, og påvises ved hjælp af journalister (fx enzym følsomme kromogent substrater, fluorophores) til Bestem antallet af phage partikler til stede. Udlæsninger (f.eks., fluorescens, absorbans) prøver kan bruges til at kvantificere ukendt koncentrationer mod phage standarder på kendte koncentrationer. Forskellige phage-baserede ringprøver er blevet udviklet, men de har potentielle begrænsninger. Den ene gruppe udviklet en papirbaseret sandwich ELISA med en kvantificering vifte, som strakte sig over syv ordrer størrelsesorden (102-109 pfu/mL); men denne metode kræver flere trin af antistof belægning og tog til en hel dag for assay8. Vores gruppe også udviklet en ELISA-metoden for at kvantificere M13 phage partikler, men havde en mindre følsomme registreringsområde af 106 til 1011 pfu/mL5. Switchable lanthanide fluorescens sonder er blevet udviklet til at optælle M13 og kvantificering data kunne opnås indenfor 20 min; denne analyse har imidlertid en snævre dynamikområde 109 1012 pfu/mL9. En gruppe bruges atomic force mikroskopi til at optælle M13 phage partikler i løsning, men det kræver avanceret elektronmikroskopi og kun arbejdede inden for et snævert interval af koncentrationer10. En anden undersøgelse bruges monodisperse emulsioner til at fælde fluorescerende M13 og T4 reporter phages og tælle phages af antallet af fluorescerende dråber; men denne tilgang også udstillet en smal kvantificering spænder fra 102 til 106 pfu/mL11. Mens droplet digital PCR har været anvendt til at kvantificere M13 phages, er denne fremgangsmåde ude af stand til at skelne mellem antallet af smitsomme og ikke-infektiøse phage partikler12.
Vores gruppe har for nylig udviklet qPCR metoder til at optælle T7 og M13 phages identificeret fra biopanning mod en blod – hjerne barrieren celle model ved hjælp af to forskellige fluorescerende reporter farvestoffer5. I forhold til ovennævnte kvantificering metoder, qPCR metoder vi udviklet var høj overførselshastighed og tid-effektive til at kvantificere mange prøver og stand til at skelne mellem smitsomme og ikke-smitsomme phages med DNase jeg forbehandling af den Phage prøver. Vigtigst, kan denne tilgang reproducerbar og nøjagtigt kvantificere M13 og T7 Bakteriofager fra biopanning prøver. Til at guide nybegyndere forskere inden for phage qPCR, beskrive her vi en detaljeret qPCR metode til at optælle T7 phage partikler fra en cystein-begrænset bibliotek (CX7C) panoreret mod en in vitro- cystisk fibrose (CF) Slim barriere. Fra dette arbejde, kan qPCR metode udvides til at kvantificere phage partikler fra andre typer af biopanning og fra andre kilder, herunder vand, jord og kropsvæsker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi udviklede qPCR metoder til at kvantificere phage genomisk DNA5, og her vi beskrevet og tilpasset en qPCR metode til at optælle T7 phages valgt mod CF-lignende Slim barriere. Minimumsoplysninger for offentliggørelse af kvantitative Real-Time PCR eksperimenter (MIQE) retningslinjer blev tilpasset til at udvikle og validere metoden qPCR opregning af T7 phages15. Den protokol, vi udviklede for at kvantificere phages fra biopanning eksperimenter er en tid-effektiv, pålid…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af PhRMA Foundation forskning Starter Grant og National Heart, Lung og Blood Institute of National Institutes of Health tilskud under award nummer R01HL138251.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
References
- Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
- Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).
- Dias-Neto, E., et al. Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis. PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).
- Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR. Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).
- Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).
- Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage. Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).
- Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR. J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).
- Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes. BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).
- Schlaman, H. R. M., et al. Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).
- Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions. Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).
- Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).
- . T7Select® Biopanning Kit Available from: https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit (2018)
- Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. Linear Regression Analysis. Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).
- Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Fittipaldi, M., et al. Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR. Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).
- Lodder, W. J., et al. Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR. Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).
- Brown-Jaque, M., et al. Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates. International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).
- Naveca, F. G., et al. Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).
- Jia, J., et al. Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR. Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).
- Bliem, R., et al. A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).
- Wan, Z., Goddard, N. L. Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study. G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).
