Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen
Summary
We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.
Abstract
De demonstratie van tyrosine kinase-remmers (TKIs) bij de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) heeft luidde een nieuw tijdperk in de therapeutiek van kanker. Echter, een kleine bevolking van cellen reageert niet op TKI behandeling, wat resulteert in minimale residuele ziekte (MRD); zelfs de meest potente TKIs ontbreek voor de uitroeiing van deze cellen. Deze cellen MRD dienen als een reservoir te ontwikkelen resistentie tegen therapie. Waarom TKI behandeling is niet effectief tegen MRD cellen is niet bekend. Groeifactor signalering is betrokken bij de ondersteuning van het voortbestaan van MRD cellen tijdens de TKI behandeling, maar een mechanistische inzicht ontbreekt. Recente studies aangetoond dat een verhoogde c-Fos en expressie van Dusp1 als gevolg van convergente oncogene en groeifactor signalering in MRD cellen TKI weerstand bemiddelen. De genetische en chemische remming van c-Fos en Dusp1 maakt van CML prachtig gevoelig voor TKIs en geneest CML in zowel genetische en gehumaniseerd Muismodellen. We deze doelgenen met behulp van meerdere microarrays van TKI-gevoelige en -resistente cellen geïdentificeerd. Wij bieden hier, methoden voor doel validatie met behulp van in vitro en in vivo Muismodellen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op geen doelstelling voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.
Introduction
Constitutieve tyrosine kinaseactiviteit van BCR-ABL1 fusion oncogen veroorzaakt CML, waarmee een grondgedachte te richten op het kinaseactiviteit door klein molecuul remmers. Het succes van TKIs bij de behandeling van CML-patiënten een revolutie teweeggebracht in het concept van gerichte therapie1,2. Anti-kinase therapie als precisie medicijn werd vervolgens ontwikkeld voor verschillende andere maligniteiten, met inbegrip van solide tumoren. Tot nu toe zijn meer dan dertig kinase-remmers goedgekeurd door de Verenigde staat FDA voor de behandeling van verschillende maligniteiten. Terwijl TKI behandeling zeer effectief is in het onderdrukken van de ziekte, is het niet curatief. Bovendien, een kleine populatie van kankercellen aanhoudt tijdens de behandeling: de MRD3,4,5. Zelfs patiënten die volledige verlossing toonde zitten met MRD, die uiteindelijk resultaten in herval zo niet voortdurend onderdrukt. Daarom is de uitroeiing van MRD cellen die nodig zijn om een duurzaam of curatieve antwoord. CML vertegenwoordigt een waardevolle paradigma voor het definiëren van het concept van precisie geneeskunde, mechanismen van oncogenese, rationeel doel-directed therapeutiek, progressie van de ziekte en resistentie. Echter, zelfs vandaag de dag, het rijden van TKI-veroorzaakte celdood in kankercellen mechanisme niet volledig wordt begrepen, noch waarom MRD cellen (bestaat uit leukemische cellen van de stam [LSCs]) intrinsiek resistent zijn tegen TKIs4,6. Niettemin, het verschijnsel van de “oncogen afhankelijkheid” mutant kinase oncoprotein is betrokken bij TKI werkzaamheid waar de acute remming van gerichte oncogen door TKIs veroorzaakt een oncogene schok die tot een enorme proapoptotic reactie of onbeweeglijkheid in cel leidt context-afhankelijke manier6,7,8,9. De mechanistische onderbouwing van oncogen afhankelijkheid ontbreekt echter. Recente studies hebben betrokken dat groeifactor signalering oncogen afhankelijkheid intrekt en bijgevolg weerstand tegen TKI therapie10,11,12 verleent. Daarom, om inzicht te krijgen in het mechanisme van oncogen afhankelijkheid, we uitgevoerd geheel-genoom expressie profilering van het BHG-ABL1 verslaafd en nonaddicted cellen (gegroeid met groeifactoren), waaruit bleek dat c-Fos en Dusp1 kritische bemiddelaars van zijn oncogen verslaving13. De genetische schrapping van c-Fos en Dusp1 is synthetische dodelijke tot de BCR-ABL1-uiting van cellen en de muizen gebruikt in het experiment deed niet leukemie te ontwikkelen. Bovendien genezen de remming van c-Fos en DUSP1 door een klein molecuul remmers CML BCR-ABL1-geïnduceerd in muizen. Uit de resultaten blijkt dat de niveaus van de expressie van c-Fos en Dusp1 de apoptotic drempel in kankercellen definiëren, zodanig dat lagere niveaus drug gevoeligheid, verlenen terwijl hogere weerstand tegen therapie13veroorzaken.
Ter identificatie van de genen die de afhankelijkheid oncogen rijden, wij meerdere geheel-genoom expressie profilering van experimenten in aanwezigheid van groeifactor en een TKI (imatinib) met behulp van de muis- zowel CML patiënt-afgeleide cellen (K562) uitgevoerd. Deze gegevens werden geanalyseerd in parallel met CML-patiënt gegevenssets verkregen CD34+ hematopoietische stamcellen voor en na behandeling met imatinib. Deze analyse bleek drie genen (een transcriptiefactor [c-Fos], dual specificiteit fosfatase 1 [Dusp1], en een RNA-bindende eiwit [Zfp36]) die worden meestal upregulated in TKI-resistente cellen. Voor het valideren van de betekenis van deze genen in de overdracht van resistentie, we stapsgewijze in vitro en in vivo analyse uitgevoerd. De niveaus van de expressie van deze genen werden bevestigd door real-time qPCR (RT-qPCR) en het westelijke bevlekken in resistente cellen. Verder, cDNA overexpressie en knockdown door shRNA haarspelden van c-Fos, Dusp1, en Zfp36 onthuld dat verhoogde c-Fos en Dusp1 expressies zijn voldoende en moeten verlenen TKI weerstand. Dus wij uitgevoerd een in vivo validatie met Muismodellen c-Fos en Dusp1 alleen. Voor de genetische validatie van c-Fos en Dusp1, we ROSACreERT-afleidbare c-Fosfl/fl muizen (voorwaardelijke knockout)14 gemaakt en stak ze met Dusp1– / – (rechte knockout)15 te maken ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – dubbel-transgene muizen. Beenmerg-afgeleide c-Kit+ cellen (vanaf c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –-, en c-Fosfl/flDusp1– / –) uitdrukken BCR-ABL1 werden geanalyseerd in vitro in een kolonie-vormende eenheid (CFU) assay, en in vivo door beenmergtransplantatie in dodelijk bestraalde muizen, voor het testen van de eis van c-Fos en Dusp1 alleen of samen in ontwikkeling van leukemie. Ook de chemische remmingen van c-Fos door DFC (difluorinated curcumine)16 en Dusp1 door het BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 werden getest in vitro en in vivo met BCR-ABL1-uiting, bot de cellen van het beenmerg-afgeleide c-Kit+ van de wild-type (WT) muis. Om te bevestigen de eis van c-Fos en Dusp1 in leukemische cellen van de stam, we gebruikt een CML muismodel waar BCR-ABL1 in de cellen van de stam specifiek was geïnduceerd door doxycycline (Tet-transactivator spreekt onder lymfkliertest stamcel leukemie (SCL) gen 3′ enhancer verordening)18,19. We gebruikten het beenmerg Lin–Sca+c-Kit+ (STL) cellen van deze muizen in een in vivo transplantatie assay. Bovendien, wij gevestigd phopsho-p38 niveaus en de uitdrukking van IL-6 als farmaco-dynamic biomarkers voor Dusp1 en c-Fos inhibitie, respectievelijk, in vivo. Ten slotte uit te breiden van de studie voor menselijk relevantie, patiënt-afgeleide CD34+ cellen (gelijk aan de c-Kit+ cellen van muizen) werden onderworpen aan langdurige in-cultuur-initiëren cel vitrotests (LTCIC) en een in vivo gehumaniseerd muismodel van CML20,21. De immunodeficiëntie muizen waren getransplanteerde met CML CD34 + cellen, gevolgd door de medicamenteuze behandeling en analyse van overleving van de menselijke leukemische cel.
In dit project ontwikkelen we methoden voor target identificatie en validaties zowel genetische en chemische hulpprogramma’s, met behulp van verschillende preklinische modellen. Deze methoden kunnen met succes worden toegepast voor het valideren van andere doelen die ontwikkeling van chemische modaliteiten voor therapeutische ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor het grootste deel van kankercellen, is het therapeutisch antwoord op TKI gemedieerd door een blokkade van de tyrosine-kinase-oncoprotein signalen waaraan de tumor verslaafd is. Echter is relatief weinig bekend over hoe een minderheid van kankercellen bij te dragen aan MRD de oncogen afhankelijkheid en therapie4ontsnappen. Recente studies is gebleken dat de groeifactor signalering medicamenteuse resistentie bij zowel de leukemie en de solide organ-tumoren bemiddelt. Dit suggereert dat verschil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn G. Q. Daley dankbaar voor het verstrekken van de BaF3 en WEHI cellen en T. Reya voor de MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP bouwt. De auteurs zijn M. Carroll dankbaar voor het verstrekken van de patiënt monsters uit de CML blast crisis. Deze studie werd ondersteund door subsidies te M.A. van de NCI (1RO1CA155091), leukemie Research Foundation en Stichting V en van de NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
