Oncogene निर्भरता में सी-फोस और Dusp1 की भूमिका के मूल्यांकन के लिए तरीके
Summary
यहां, हम सी के आनुवंशिक और रासायनिक सत्यापन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन-फोस और ल्यूकेमिया में एक दवा लक्ष्य के रूप में Dusp1 इन विट्रो में और vivo में आनुवंशिक और मानव माउस मॉडल का उपयोग कर । इस विधि को आनुवंशिक सत्यापन और चिकित्सीय विकास के लिए किसी भी लक्ष्य पर लागू किया जा सकता है ।
Abstract
पुरानी माइलॉयड ल्यूकेमिया (CML) के इलाज में tyrosine कळेनासे अवरोधकों (TKIs) का प्रदर्शन कैंसर चिकित्सकीय में एक नए युग की शुरुआत की है । हालांकि, कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी TKI उपचार का जवाब नहीं है, न्यूनतम अवशिष्ट रोग (MRD) में जिसके परिणामस्वरूप; यहां तक कि सबसे शक्तिशाली TKIs इन कोशिकाओं के उन्मूलन में विफल । इन MRD कोशिकाओं को चिकित्सा के लिए प्रतिरोध विकसित करने के लिए एक जलाशय के रूप में सेवा । क्यों TKI उपचार MRD कोशिकाओं के खिलाफ अप्रभावी है ज्ञात नहीं है । विकास कारक संकेतन TKI उपचार के दौरान MRD कोशिकाओं के अस्तित्व के समर्थन में फंसा है, लेकिन एक यंत्रवत समझ की कमी है । हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि एक उंनत सी-फोस और अभिसरण oncogenic और विकास MRD कोशिकाओं में संकेत कारक TKI प्रतिरोध मध्यस्थता का एक परिणाम के रूप में Dusp1 अभिव्यक्ति । सी के आनुवंशिक और रासायनिक निषेध-फोस और Dusp1 renders CML अति सुंदर TKIs और इलाज के लिए संवेदनशील दोनों आनुवंशिक और मानव माउस मॉडल में CML । हम इन लक्ष्य TKI-संवेदनशील और प्रतिरोधी कोशिकाओं से कई microarrays का उपयोग कर जीन की पहचान की । यहां, हम इन विट्रो और vivo माउस मॉडल में उपयोग लक्ष्य सत्यापन के लिए विधियाँ प्रदान करते हैं । इन तरीकों को आसानी से आनुवंशिक सत्यापन और चिकित्सीय विकास के लिए किसी भी लक्ष्य को लागू किया जा सकता है ।
Introduction
BCR के गठन tyrosine कळेनासे गतिविधि-ABL1 संलयन oncogene कारण CML, जो छोटे अणु अवरोधकों द्वारा कळेनासे गतिविधि को लक्षित करने के लिए एक तर्क प्रदान करता है । CML रोगियों के इलाज में TKIs की सफलता लक्षित थेरेपी1,2की अवधारणा में क्रांति । बाद में, विरोधी कळेनासे चिकित्सा परिशुद्धता दवा के रूप में ठोस ट्यूमर सहित कई अन्य द्रोही के लिए विकसित किया गया था. अब तक, तीस से अधिक कळेनासे अवरोधकों विभिंन दुष्टता के इलाज के लिए संयुक्त राज्य एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है । जबकि TKI उपचार रोग को दबाने में बहुत प्रभावी है, यह उपचारात्मक नहीं है । इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी उपचार के दौरान बनी हुई है: MRD3,4,5। यहां तक कि रोगियों को जो पूरा छूट दिखाया MRD, जो अंततः पतन में परिणाम नहीं अगर लगातार दबा के साथ छोड़ दिया जाता है । इसलिए, MRD कोशिकाओं के उंमूलन के लिए एक टिकाऊ या उपचारात्मक प्रतिक्रिया प्राप्त करने की जरूरत है । CML परिशुद्धता दवा की अवधारणा को परिभाषित करने के लिए एक मूल्यवान प्रतिमान का प्रतिनिधित्व करता है, oncogenesis के तंत्र, तर्कसंगत लक्ष्य-चिकित्सकीय निर्देशित, रोग प्रगति, और दवा प्रतिरोध । हालांकि, आज भी, TKI ड्राइविंग तंत्र कैंसर कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु प्रेरित पूरी तरह से समझ नहीं है, और न ही क्यों MRD कोशिकाओं (ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम कोशिकाओं के शामिल [LSCs]) आंतरिक रूप से4TKIs,6के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । बहरहाल, घटना “oncogene निर्भरता” के उत्परिवर्ती कळेनासे oncoprotein TKI प्रभावकारिता में फंसा जहां oncogene द्वारा लक्षित TKIs के तीव्र निषेध एक oncogenic झटका है कि एक बड़े पैमाने पर proapoptotic प्रतिक्रिया या सेल में quiescence की ओर जाता है का कारण बनता है प्रसंग-निर्भर रीति6,7,8,9। तथापि, oncogene स्वावलम्बन की यंत्रवत underpinning कमी आहे. हाल के अध्ययनों से यह है कि विकास कारक abrogates oncogene निर्भरता संकेतन और फलस्वरूप TKI चिकित्सा के लिए प्रतिरोध प्रदान फंसा है10,11,12। इसलिए, oncogene निर्भरता के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हम पूरे BCR-ABL1 आदी और नशे की लत कोशिकाओं (विकास कारकों के साथ बड़े), जो पता चला है कि सी-फोस और Dusp1 के महत्वपूर्ण मध्यस्थों है से profiling अभिव्यक्ति प्रदर्शन किया oncogene व्यसन१३. सी-फोस और Dusp1 के आनुवंशिक विलोपन BCR-ABL1-व्यक्त कोशिकाओं के लिए कृत्रिम घातक है और प्रयोग में इस्तेमाल चूहों ल्यूकेमिया विकसित नहीं किया । इसके अलावा, छोटे अणु अवरोधकों द्वारा सी-फोस और DUSP1 की बाधा चूहों में BCR-ABL1-प्रेरित CML को ठीक कर. परिणाम बताते हैं कि सी-फोस और Dusp1 की अभिव्यक्ति का स्तर कैंसर की कोशिकाओं में अपोप्तोटिक दहलीज को परिभाषित करता है, इस तरह कि निचले स्तर दवा संवेदनशीलता प्रदान करते हुए उच्च स्तर13चिकित्सा के लिए प्रतिरोध का कारण.
oncogene निर्भरता ड्राइविंग जीन की पहचान करने के लिए, हम विकास कारक की उपस्थिति और एक TKI (imatinib) दोनों माउस का उपयोग करते हुए और CML रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं (K562) में कई पूरे जीनोम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन प्रयोग किया । इन आंकड़ों CML रोगी डेटा CD34+ टेम स्टेम कोशिकाओं से पहले और imatinib के साथ उपचार के बाद से प्राप्त सेट के साथ समानांतर में विश्लेषण किया गया । इस विश्लेषण से तीन जीनों का पता चला (एक प्रतिलेखन कारक [c-फोस], दोहरी विशिष्टता फॉस्फेट 1 [Dusp1], और एक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन [Zfp36]) जो सामान्यतः TKI-प्रतिरोधी कोशिकाओं में विनियमित होते हैं । दवा प्रतिरोध प्रदान करने में इन जीनों के महत्व को मान्य करने के लिए, हम कदम-दर-कदम इन विट्रो में और vivo विश्लेषण में किए गए. इन जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर की पुष्टि रीयल-टाइम qPCR (RT-qPCR) और पश्चिमी सोख्ता की दवा प्रतिरोधी कोशिकाओं में की गई. इसके अलावा, सी-फोस, Dusp1, और Zfp36 के shRNA hairpins द्वारा सीडीएनए और पछाड़ना से पता चला कि ऊंचा सी-फोस और Dusp1 भाव पर्याप्त हैं और TKI प्रतिरोध प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं । इसलिए, हम vivo मांयता में सी-फोस और Dusp1 के साथ माउस मॉडल का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया । सी-फोस और Dusp1 के आनुवंशिक सत्यापन के लिए, हम ROSACreERT-inducible सी-फोसfl/fl चूहों (सशर्त नॉकआउट)14 और Dusp1 के साथ उन्हें पार कर-/ (सीधे नॉकआउट)15 बनाने के लिए ROSACreERT2-सी-फोसfl/ Dusp1-/- डबल-ट्रांसजेनिक चूहों । अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न सी किट+ कोशिकाओं (से सी-फोसfl/fl-, Dusp1-/-, और सी-फोसfl/flDusp1-/एक्सप्रेस BCR-ABL1 में इन विट्रो में विश्लेषण किया गया एक कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) परख, और में घातक विकिरणित चूहों में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण द्वारा vivo, सी-फोस और Dusp1 की आवश्यकता का परीक्षण करने के लिए अकेले या एक साथ ल्यूकेमिया विकास में. इसी तरह, सी-फोस के रासायनिक अवरोधों द्वारा डीएफसी (difluorinated curcumin)16 और Dusp1 द्वारा बीसीआई (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2, 3-dihydro-a-inden-1-एक)17 इन विट्रो में परीक्षण किया गया और vivo in BCR-ABL1-expression, अस्थियों का प्रयोग मज्जा-व्युत्पंन सी किट+ जंगली प्रकार (WT) माउस से कोशिकाओं । ल्यूकेमिया से प्रभावित स्टेम सेल में सी-फोस और Dusp1 की आवश्यकता की पुष्टि करने के लिए, हमने एक CML माउस मॉडल का उपयोग किया जहां BCR-ABL1 को doxycycline (Tet-transactivator एक्सप्रेस के तहत murine स्टेम कोशिका ल्यूकेमिया (SCL) जीन 3 ‘ बढ़ाने के द्वारा विशेष रूप से अपने स्टेम कोशिकाओं में प्रेरित था विनियमन)18,19. हम एक में vivo प्रत्यारोपण परख में इन चूहों से अस्थि मज्जा लिन–Sca+सी-किट+ (LSK) कोशिकाओं का इस्तेमाल किया । इसके अलावा, हम phopsho-p38 स्तर और IL-6 की अभिव्यक्ति की स्थापना की pharmaco के रूप में Dusp1 और सी फोस अवरोध, vivo मेंक्रमशः, के लिए गतिशील । अंत में, मानव प्रासंगिकता के लिए अध्ययन का विस्तार करने के लिए, रोगी व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं (सी के समकक्ष-किट+ चूहों से कोशिकाओं) लंबे समय के अधीन थे इन विट्रो संस्कृति-सेल परख (LTCIC) की शुरुआत और vivo में एक मानव माउस मॉडल की CML20,21. immunodeficient चूहों CML CD34 + कोशिकाओं, दवा उपचार और मानव ल्यूकेमिया से प्रभावित सेल अस्तित्व के विश्लेषण के बाद के साथ प्रत्यारोपण किया गया ।
इस परियोजना में, हम दोनों आनुवंशिक और रासायनिक उपकरणों का उपयोग कर लक्ष्य पहचान और वैध, के लिए तरीकों को विकसित करने, विभिंन नैदानिक मॉडल का उपयोग । इन पद्धतियों सफलतापूर्वक चिकित्सीय विकास के लिए रासायनिक मोडलों के विकास के अंय लक्ष्यों को मांय करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर कोशिकाओं के थोक के लिए, TKI के लिए चिकित्सीय प्रतिक्रिया tyrosine-कळेनासे-oncoprotein संकेत है जो ट्यूमर आदी है की नाकाबंदी द्वारा मध्यस्थता है । हालांकि, अपेक्षाकृत कम कैसे कैंसर MRD योगदान oncogene निर्भरता और<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक जी. क्यू. Daley को BaF3 और WEHI कोशिकाओं और रेया के लिए MSCV-BCR-ABL-आयरेस-YFP construction प्रदान करने के लिए आभारी हैं. लेखकों CML विस्फोट संकट से रोगी के नमूने प्रदान करने के लिए एम कैरोल के आभारी हैं । यह अध्ययन NCI (1RO1CA155091), ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन और वी फाउंडेशन, और NHLBI (R21HL114074-01) से एमए करने के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
