Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene
Summary
Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.
Abstract
La dimostrazione di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia mieloide cronica (CML) ha segnato una nuova era nella terapeutica del cancro. Tuttavia, una piccola popolazione di cellule non risponde al trattamento TKI, con conseguente malattia minima residua (MRD); anche il più potente TKI non riescono a sradicare queste cellule. Queste cellule MRD servono come un serbatoio di sviluppare una resistenza alla terapia. Non è noto perché TKI trattamento è inefficace contro le cellule MRD. Segnalazione di fattore di crescita è implicato nel sostenere la sopravvivenza delle cellule MRD durante il trattamento TKI, ma una comprensione meccanicistica è carente. Studi recenti hanno dimostrato che un elevato c-Fos e Dusp1 espressione come risultato di convergenti oncogeno e segnalazione in cellule di MRD di fattore di crescita mediano resistenza TKI. L’inibizione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 rende squisitamente sensibile a TKI CML e cure CML in entrambi i modelli genetici e umanizzato del mouse. Abbiamo identificato questi geni bersaglio usando i microarrays multiple da TKI-sensibile e – cellule resistenti. Qui, mettiamo a disposizione metodi per la convalida di destinazione utilizzando modelli murini in vitro e in vivo. Questi metodi possono essere applicati facilmente a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.
Introduction
Attività della chinasi della tirosina costitutiva dell’oncogene di fusione BCR-ABL1 provoca CML, che fornisce una spiegazione razionale per indirizzare l’attività della chinasi di piccole molecole inibitrici. Il successo di TKI nel trattamento di pazienti affetti da LMC ha rivoluzionato il concetto di terapia mirata1,2. Successivamente, la terapia anti-chinasi come medicina di precisione è stata sviluppata per parecchie altre malignità, compreso i tumori solidi. Finora, più di trenta gli inibitori della chinasi sono stati approvati dalla FDA stato Uniti per il trattamento di vari tumori maligni. Mentre TKI trattamento è molto efficace nel sopprimere la malattia, non è curativo. Inoltre, una piccola popolazione di cellule tumorali persiste durante il trattamento: il MRD3,4,5. Anche i pazienti che hanno mostrato la remissione completa sono lasciati con MRD, che alla fine risultati nella ricaduta se non continuamente repressa. Di conseguenza, l’eliminazione delle cellule MRD è necessario per raggiungere una risposta durevole o curativa. CML rappresenta un paradigma prezioso per definire il concetto di medicina di precisione, meccanismi di oncogenesi, la terapeutica razionale destinazione-diretto, progressione di malattia e resistenza ai farmaci. Tuttavia, ancora oggi, il meccanismo di guida morte TKI-indotta delle cellule in cellule di cancro non è pienamente compreso, né perché sono intrinsecamente resistenti a TKI4,6celle MRD (costituite da cellule staminali leucemiche [LSCs]). Tuttavia, il fenomeno della “dipendenza dell’oncogene” chinasi mutante oncoproteina è implicato nell’efficacia TKI dove l’inibizione acuta dell’oncogene mirati da TKI provoca uno shock oncogeno che conduce a una risposta massiccia proapoptotic o quiescenza in cella contesto-dipendente6,7,8,9. Tuttavia, la base meccanicistica della dipendenza dell’oncogene è carente. Studi recenti hanno implicato che fattore di crescita di segnalazione abroga la dipendenza dell’oncogene e di conseguenza conferisce resistenza al TKI terapia10,11,12. Di conseguenza, per comprendere il meccanismo di dipendenza dell’oncogene, abbiamo effettuato delineamento di espressione intero genoma da BCR-ABL1 addicted e cellule nonaddicted (sviluppate con fattori di crescita), che ha rivelato che il c-Fos e Dusp1 sono mediatori critici di oncogene dipendenza13. La delezione genetica di c-Fos e Dusp1 è letale per BCR-ABL1-espressione sintetiche cellule e i topi utilizzati nell’esperimento non hanno sviluppato la leucemia. Inoltre, l’inibizione di c-Fos e DUSP1 di piccole molecole inibitrici curata LMC BCR-ABL1-indotta in topi. I risultati mostrano che i livelli di espressione di c-Fos e Dusp1 definiscono la soglia apoptotica in cellule tumorali, tale che i livelli più bassi conferiscono sensibilità ai farmaci, mentre livelli più elevati causano resistenza alla terapia13.
Per identificare i geni che guida la dipendenza dell’oncogene, abbiamo effettuato diversi esperimenti in presenza di fattore di crescita e un TKI (imatinib) utilizzo del mouse – e cellule di derivazione paziente CML (K562) del profilo di espressione di intero genoma. Questi dati sono stati analizzati in parallelo con CML paziente set di dati ottenuti da CD34+ cellule staminali ematopoietiche prima e dopo il trattamento con imatinib. Questa analisi ha rivelato tre geni (un fattore di trascrizione [c-Fos], specificità dual fosfatasi 1 [Dusp1] e una proteina di legame al RNA [Zfp36]) che comunemente sono sovraregolati in cellule TKI-resistenti. Per convalidare l’importanza di questi geni che conferiscono resistenza ai farmaci, abbiamo effettuato la dettagliata analisi in vitro e in vivo . I livelli di espressione di questi geni sono stati confermati mediante qPCR in tempo reale (RT-qPCR) e western blotting in cellule resistenti alla droga. Ulteriormente, la sovraespressione di cDNA e atterramento di shRNA forcine di c-Fos, Dusp1, e Zfp36 ha rivelato che elevati c-Fos e Dusp1 espressioni sono sufficienti e necessarie per conferire resistenza TKI. Di conseguenza, abbiamo effettuato una convalida in vivo utilizzando modelli murini con c-Fos e Dusp1 solo. Per la validazione genetica di c-Fos e Dusp1, abbiamo creato ROSACreERT-inducible c-Fosfl/fl topi (knockout condizionale)14 e li ha attraversato con Dusp1– / – (dritto knockout)15 per rendere ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – topi transgenici doppio. Cellule derivate da midollo osseo c-Kit+ (da c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –– e c-Fosfl/flDusp1– / –) che esprimono BCR-ABL1 sono stati analizzati in vitro in un saggio di formazione di colonie unit (CFU) e in vivo da trapianto di midollo osseo in topi irradiati letalmente, per testare il requisito di c-Fos e Dusp1 da soli o insieme a sviluppo di leucemia. Allo stesso modo, le inibizioni chimiche di c-Fos di DFC (difluorinated curcumina)16 e Dusp1 di BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 sono stati testati in vitro e in vivo usando BCR-ABL1-esprimendo, osso cellule derivate dal midollo c-Kit+ dal mouse wild type (WT). Per confermare la richiesta di c-Fos e Dusp1 in cellule staminali leucemiche, abbiamo utilizzato un modello murino CML dove BCR-ABL1 specificamente è stata indotta in sue cellule staminali di doxiciclina (esprime Tet-transactivator sotto cellule staminali murine leucemia (SCL) gene 3′ enhancer regolamento)18,19. Abbiamo usato il midollo osseo Lin–cellule c-Kit di Sca++ (TSS) da questi topi in un’analisi di trapianto in vivo. Inoltre, abbiamo stabilito i livelli di phopsho-p38 e l’espressione di IL-6 come biomarcatori di farmacodinamica per Dusp1 e l’inibizione di c-Fos, rispettivamente, in vivo. Infine, di estendere lo studio per rilevanza umana, CD34 paziente-derivati+ cellule (equivalente alle cellule c-Kit+ da topi) sono stati sottoposti a lungo termine saggi in vitro d’inizio coltura cellulare (LTCIC) e un modello di topo umanizzato in vivo di CML20,21. I topi immunodeficienti sono stati trapiantati con cellule di CML CD34 +, seguite da trattamento farmacologico e l’analisi di sopravvivenza delle cellule leucemiche umane.
In questo progetto, sviluppiamo metodi per l’identificazione del target e convalide utilizzando strumenti sia genetici e chimici, utilizzando diversi modelli preclinici. Questi metodi possono essere applicati con successo per convalidare altri obiettivi lo sviluppo di modalità di chimica per lo sviluppo terapeutico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per la maggior parte delle cellule tumorali, la risposta terapeutica a TKI è mediata da un blocco di tirosina-chinasi-oncoproteina segnali a cui il tumore è assuefatto. Tuttavia, relativamente poco è conosciuto circa come una minoranza delle cellule tumorali, contribuendo alla MRD escape l’oncogene dipendenza e terapia4. Studi recenti hanno rivelato che la segnalazione di fattore di crescita media farmacoresistenza in leucemia e tumori solidi dell’organo. Ciò suggerisce che vari meccanismi mol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati a G. Q. Daley per fornire le cellule BaF3 e WEHI e Reya T. per la MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP costruisce. Gli autori sono grati a Carroll M. per la fornitura dei campioni da crisi di scoppio CML. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a M.A. da NCI (1RO1CA155091), la leucemia Research Foundation e Fondazione V e da NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
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