Нейтрофильные внеклеточного ловушки, порожденных низкой плотности нейтрофилов получены перитонеальный лаваж жидкости посредником рост опухолевых клеток и вложения
Summary
Здесь мы представляем метод, в котором low-density нейтрофилов человека (LDN), оправился от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости, производят массовые нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) и эффективно ловушки бесплатно опухолевых клеток, которые впоследствии растут.
Abstract
Активация нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), которые могут захватить и уничтожить микробов. Последние исследования показывают, что сети участвуют в различных процессах болезни, например, аутоиммунные заболевания, тромбоз и опухолевых метастаз. Здесь мы покажем подробный в vitro технику для выявления чистой активности во время треппинга бесплатно опухолевых клеток, которые растут после присоединения к сети. Во-первых мы собрали низкой плотности нейтрофилов (LDN) от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости из пациентов, перенесших лапаротомию. Краткосрочные культивирования LDN привели к массовым NET формирования, который был визуализирован с зеленый люминесцентной ядерных и хромосомы изображение. После совместного инкубации линий клеток человека рак желудка, MKN45, OCUM-1 и NUGC-4 с сеткой Нетс были ловушку многие опухолевых клеток. Впоследствии вложение был полностью отменен, деградация сетей с DNase I. Time-lapse видео показали, что клетки опухоли, захваченных Нетс не умрет, но вместо энергично вырос в непрерывной культуры. Эти методы могут применяться для обнаружения клей взаимодействия сетей и различных видов клеток и материалов.
Introduction
Превращение ядерной нейтрофилов в циркулирующей крови обычно отделяются от мононуклеарных клеток через метод подготовки градиента плотности. Однако некоторые нейтрофилов, известный как low-density нейтрофилов (LDN), с CD11b(+), CD15(+), CD16(+) и CD14(-) фенотипов, совместной очищенную с мононуклеарных клеток. Относительное количество LDN значительно увеличивается при различных патологических состояниях, включая аутоиммунные заболевания1,2, сепсис3и рак4,5. Предыдущие исследования показали, что LDN являются фенотипически и функционально собственный класс6нейтрофилы. Следует отметить, что LDN в циркулирующей крови чаще производить нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), чем нормальной густоты нейтрофилов2,7. Нетс веб как структуры, состоящий из нуклеиновых кислот, гистонов, протеаз и гранулированных и цитозольной белков, и они могут эффективно завлечь и уничтожить патогенов8.
Недавно было показано сеток захватить не только микробы, но и тромбоцитов и циркулирующих клеток опухоли, которые могут помочь в тромба формирования9 и опухолевых метастаз10,11. Однако молекулярные механизмы за клей взаимодействия сетей и тромбоцитов или опухолевых клеток по-прежнему неясны. Совсем недавно в пробирке адгезии assay показали, что клетки миелоидного лейкоза (12K562) и клетки карциномы легких (13A549) придают сетей через β1 и β3 интегринов. Авторы использовали чистых запасов изолированы от нейтрофилов и активированную phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) как субстрат адгезии14. Хотя этот assay позволяет определение реальных взаимодействий с чистой компонентами в отсутствие нейтрофилов, это спорный ли «клеток свободный чистых запасов» изолированные высокоскоростной центрифугированием сохраняет молекулярной структурой, идентичной сетки производится в VIVO. Недавно мы нашли что перитонеальный лаваж жидкости после абдоминальной хирургии содержатся многие пожилые LDN, который генерируется массивные сеток и придает опухолевых клеток, вызывая перитонеальных метастазов15. В этом исследовании мы успешно изучили адгезию опухолевых клеток с нетронутыми сеток без каких-либо физических манипуляций. Здесь мы показать детали техники для обнаружения клей взаимодействия сетей и бесплатные опухолевых клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие исследования сообщили, что циркулирующих клеток опухоли могут быть захваченных чистой подложки в естественных условиях10,11. Метастатическим груди раковых клеток было показано для стимуляции нейтрофилов и стимулировать формирование сет…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-жа J. Shinohara и I. Nieda для технического и канцелярской работы. Кроме того мы благодарим Drs. Shiro Мацумото, Hidenori Харута, Кентаро Kurashina и Кадзуя Такахаси за их сотрудничество в целях приобретения образца в операционной комнате. Эта работа была поддержана целевые субсидии для проведения научных исследований от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии и японского общества для содействия развитию науки (17K 10606).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Recherche en cancérologie. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Recherche en cancérologie. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
