נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.
Abstract
הפעלת נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), אשר יכולים ללכוד ולהשמיד חיידקים. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי רשתות מעורבים בתהליכי מחלה שונים, כגון גרורות המחלה פקקת, הגידול אוטואימוניות. כאן, אנו מראים טכניקה מפורט במבחנה לזיהוי פעילות נטו במהלך לכידה של תאים סרטניים חינם, אשר גדלים לאחר חיבור רשתות. ראשית, אספנו בצפיפות נמוכה נויטרופילים (-כעבור שנה.-) של נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח בחולים שעברו laparotomies. Culturing לטווח קצר של-כעבור שנה-הביא שמצביעה נטו מסיבית היה מדמיין עם גרעיני ירוק פלורסנט, כרומוזום counterstain. לאחר דגירה שיתוף של שורות תאים סרטן קיבה אנושית MKN45, OCUM-1 ו- NUGC-4 עם הרשתות, תאים סרטניים רבים נלכדו על ידי הרשתות. כתוצאה מכך, הקובץ המצורף היה יושב לחלוטין על ידי ההשפלה של רשתות עם Time-lapse אני DNase הסרטונים גילה כי תאים סרטניים, שנלכד על ידי הרשתות לא מת, אבל במקום גדל נמרצות בתרבות רציפה. שיטות אלה ניתן להחיל את הגילוי של דבק אינטראקציות בין רשתות סוגים שונים של תאים וחומרים.
Introduction
פולימורף נויטרופילים גרעיני במחזור הדם מופרדים בדרך כלל תאי תאי דרך שיטת הכנה הדרגתיות צפיפות. עם זאת, כמה נויטרופילים הידוע בשם נויטרופילים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), עם פנוטיפים CD11b(+), CD15(+), CD16(+), CD14(-), הם מטוהרים במשותף עם תאי תאי. המספר היחסי של-כעבור שנה-מגדיל באופן משמעותי בתנאים פתולוגיים שונים, כולל מחלות אוטואימוניות1,2, אלח דם3ו-4,סרטן5. מחקרים קודמים הראו כי-כעבור שנה-מחלקה phenotypically והן מבחינה תפקודית ברורים של נויטרופילים6. יצוין, כי-כעבור שנה-במחזור הדם הם נוטים יותר לייצר מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) מצפיפות נורמלי נויטרופילים2,7. הרשתות הן מבנים דמויי-אינטרנט המורכב של חומצות גרעין, שינויים היסטוניים, פרוטאזות, חלבונים פרטנית ו cytosolic, הם ביעילות במלכודת, להרוס פתוגנים8.
לאחרונה, רשתות הוכחו ללכוד לא רק חיידקים, אבל גם טסיות דם ופיזור תאים סרטניים, אשר יכולים לסייע כגון היווצרות9 וגידול גרורות10,11. עם זאת, המנגנונים המולקולריים מאחורי האינטראקציות דבק בין רשתות, טסיות דם או תאים סרטניים נמצאים עדיין לא ברור. לאחרונה, assay אדהזיה במבחנה גילה כי תאים לוקמיה מיאלואידית (K56212) ותאים קרצינומה של הריאות (A54913) לצרף רשתות באמצעות אינטגרינים β1 וβ3. המחברים השתמשו נטו מניות מבודד נויטרופילים ומופעל על ידי phorbol 12-פעילים 13-אצטט (PMA) המצע אדהזיה14. למרות assay זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות אמיתי עם רכיבים נטו בהיעדרו של נויטרופילים, זה לנתיחה אם “התא ללא מניות נטו” מבודדת על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה משמרת את המבנה המולקולרי זהה רשתות המיוצר ב ויוו. לאחרונה, מצאנו את נוזל שטיפת הצפק לאחר ניתוח בבטן הכיל הרבה בוגרים-כעבור שנה-, אשר נוצר רשתות מסיבי המוצמדות לתאים הגידול גורם גרורות הצפק15. במחקר זה, בדקנו בהצלחה את הידבקות תאים סרטניים רשתות שלמות ללא כל פעולה פיזית. כאן, אנו מראים פרטים של טכניקה לגילוי דבק אינטראקציות בין רשתות תאים סרטניים חינם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים דיווחו כי מחזורי תאים סרטניים יכולים להיות. לכוד סובסטרטים נטו ויוו10,11. תאי סרטן שד גרורתי הוכחו לעורר נויטרופילים, זירוז היווצרות של רשתות, אשר מסייע צמיחת תאים סרטניים גידולים איבר המטרה17. בנוסף, מצאנו כי של נוזל שטיפה לאחר …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים גברת ג’יי שינוהרה, אני Nieda על עבודה טכנית, קלריקלי. כמו כן, אנו מודים ד”ר שירו מאצומוטו, Hidenori Haruta, Kurashina קנטארו ו Kazuya טקהאשי על שיתוף הפעולה שלהם עבור רכישת המדגם בחדר ניתוח. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי של משרד החינוך, המדע, הספורט, ואת התרבות של יפן והחברה יפן הקידום של המדע (17K 10606).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Recherche en cancérologie. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Recherche en cancérologie. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
