Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali
Summary
Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.
Abstract
Attiva i neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), che possono catturare e distruggere i microbi. Studi recenti suggeriscono che le reti siano coinvolti nei vari processi di malattia, quali le metastasi del tumore, la trombosi e la malattia autoimmune. Qui, ci mostra una tecnica dettagliata in vitro per rilevare attività netto durante l’intrappolamento delle cellule del tumore libero, che si sviluppano dopo allegato ai NETs. In primo luogo, abbiamo raccolto i neutrofili a bassa densità (LDN) dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatorio da pazienti sottoposti a laparotomie. Coltura a breve termine di LDN provocato dalla massiccia formazione netta che è stato visualizzato con verde fluorescente nucleare e colorante di contrasto del cromosoma. Dopo co-incubazione di linee cellulari di cancro gastrico umano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 con le reti, molte cellule del tumore erano intrappolate dai NETs. Successivamente, l’allegato completamente è stata abrogata dal degrado delle reti con dnasi I. Time-lapse video ha rivelato che le cellule del tumore intrappolate dalle reti non è morto ma invece è cresciuta vigorosamente in una cultura di continua. Questi metodi possono essere applicati alla rilevazione di interazioni adesive tra reti e vari tipi di cellule e materiali.
Introduction
Neutrofili nucleari polimorfo nel sangue circolante in genere sono separati dalle cellule mononucleari attraverso il metodo di preparazione gradienti di densità. Tuttavia, alcuni neutrofili conosciuti come i neutrofili a bassa densità (LDN), con i fenotipi di CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), sono co-purificati con cellule mononucleari. Il numero relativo di LDN aumenta significativamente in varie condizioni patologiche tra cui malattie autoimmuni1,2, sepsi3e cancro4,5. Gli studi precedenti hanno dimostrato che LDN sono una classe fenotipico e funzionalmente distinta di neutrofili6. Dovrebbe essere notato che LDN nel sangue circolante sono più probabilità di produrre trappole extracellulari del neutrofilo (reti) di densità normale neutrofili2,7. Le reti sono web-come strutture composte di acidi nucleici, istoni, proteasi e proteine citosoliche e granulare, e in modo efficiente possono intrappolare e distruggere gli agenti patogeni8.
Recentemente, le reti hanno dimostrate di catturare non solo i microbi, ma anche le piastrine e cellule tumorali che possono assistere all’embolo formazione9 e tumore metastasi10,11circolanti. Tuttavia, i meccanismi molecolari dietro le interazioni adesive tra reti e piastrine o le cellule del tumore sono ancora poco chiari. Più recentemente, un’analisi di adesione in vitro hanno rivelato che le cellule di leucemia mieloide (K56212) e cellule di carcinoma del polmone (A54913) alleghino alle reti tramite le integrine β1 e β3. Gli autori hanno usato stock netto isolato dai neutrofili e attivato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) come il substrato di adesione14. Anche se questo test permette di individuare i reali interazioni con componenti netti in assenza di neutrofili, è discutibile se il “cell-free stock netto” isolato mediante centrifugazione ad alta velocità mantiene la struttura molecolare identica ai NETs prodotto in vivo. Recentemente, abbiamo trovato quel liquido di lavaggio peritoneale dopo chirurgia addominale conteneva molti LDN maturo, che generò massicce reti e attaccato alle cellule del tumore che causano metastasi peritoneali15. In questo studio, abbiamo esaminato con successo l’adesione delle cellule del tumore ai NETs intatto senza alcuna manipolazione fisica. Qui, indichiamo i dettagli di una tecnica per rilevare interazioni adesive tra le reti e le cellule del tumore libero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi precedenti hanno segnalato che cellule tumorali circolanti possono essere intrappolati dal netto substrati in vivo10,11. Cellule di carcinoma mammario metastatico sono state indicate per stimolare i neutrofili e indurre la formazione di reti, che assiste nella crescita delle cellule del tumore nell’ organo bersaglio17. Inoltre, abbiamo trovato che colture di breve durata di LDN dal fluido di lavaggio postoperatorio prodo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sig. ra J. Shinohara e I. Nieda per il lavoro di tecnico e di segreteria. Inoltre, ringraziamo la d. ssa Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina e Kazuya Takahashi per la loro collaborazione per l’acquisizione del campione in sala operatoria. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per la ricerca scientifica dal Ministero dell’istruzione, scienza, sport e cultura del Giappone e della Japan Society per la promozione della scienza (17K 10606).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
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