我们目前使用2光子显微术在鲍曼的小鼠泌尿空间内放置一个微量吸管, 结合2个肾脏生理学的基础技术。使用2光子显微术克服了传统显微术微穿刺肾脏生理学研究的关键局限性。
肾脏微穿刺和肾脏 2-光子成像是肾脏生理学的精技术。然而, 微穿刺是有限的依赖于传统显微学的表面保留肾单位特征, 和2光子研究是有限的干预只能在器官, 而不是保留肾单位水平评估。特别是小鼠肾小球的微穿刺研究受到小鼠表面肾小球缺乏的挑战。为了解决这一局限性, 为了研究从鲍曼的空间在小鼠生理模型中的吸液, 我们开发了2光子肾小球微穿刺。我们提出一种新的手术准备, 允许横向访问肾脏, 同时保留所需的垂直成像柱2光子显微镜。高分子量的荧光素异硫氰酸酯 (FITC)-葡聚糖的施用用于呈现肾脏血管, 因此2光子成像可见的肾小球。然后在立体定向指导下引入一个量子点涂层移液器, 将其从几个到许多, 在成像窗口中进行可视化。在本协议中, 我们提供了执行该程序所需的准备、材料和方法的详细信息。这项技术促进了以前不可能的肾脏生理学研究, 包括从鲍曼的空间和保留肾单位的所有部分的成像深度限制, 约100µm 在肾囊下恢复滤液。压力、电荷和流量均可使用引入的移液器进行测量。在这里, 我们提供从鲍曼的空间抽吸液相色谱/质谱的代表性数据。我们期望这种技术在肾脏生理调查中具有广泛的适用性。
该程序的目的是提供常规微穿刺访问鲍曼的空间和其他肾小球结构的小鼠。微穿刺对肾脏生理学的研究仅限于1光子显微镜, 它只能在肾脏表面的几微米内成像, 并且在 z 维度上提供了有限的精度。由于小鼠表面的肾小球很少, 因此在1光子显微镜下找不到表面肾小球是不可能的, 因此大多数微穿刺的研究都是在慕尼黑大鼠身上进行的, 其中有更多的表面肾小球。因此, 在小鼠模型中工作的好处在微穿刺研究中被限制在1,2,3。成像技术的最新进展, 包括显微 CT4、5、纳米粒子成像6和成像质谱仪7大大提高了适用于肾小球生理学的模式范围, 但微穿刺提供的干预和样品的独特能力仍然无法替代。因此, 使用此处提供的技术扩展微穿刺的使用有望促进新的肾脏生理学研究, 特别是对肾脏滤液 (即代谢组学) 的含量和基本生理学的评价。转基因小鼠, 如滤液压力和电荷的测量, 以前只在大鼠身上进行。
在这项技术中, 使用2光子显微镜可以可视化和微量吸管访问肾脏结构高达约100µm 肾囊下。因此, 多 (5–10) 的肾小球可供微穿刺在每个小鼠肾脏迄今成像。虽然该技术与传统的肾脏微穿刺有一定的特点, 但它是设计出来的, 需要从传统的技术进行广泛的修改。在本协议中, 我们展示了从鲍曼的空间中吸取流体的渴望, 并显示了随后的分析与质谱 (nanoproteomics)8、9、10、11的例子结果。质谱的下游使用需要专门的样品制备工作流程, 这里也展示了这一点。
我们提出了一个方法来访问鲍曼的小鼠非表面肾小球的空间, 通过2光子显微镜的帮助。我们开发了这个程序来解决肾小球微穿刺的一个关键限制, 在小鼠1光子显微镜下可寻址的表面肾小球的稀有性, 为了促进实验目标, 从鲍曼的空间中吸取流体的渴望后续分析。这项技术的发展和实践有赖于六个关键步骤。首先, 必须仔细地进行新的手术准备, 使成像水柱不会从盖玻片上脱落, 而在肾脏的范围内, 这是移液器的目标。其次, 用于微穿刺的玻璃移液器必须在2光子显微镜下可见, 这是使用量子点完成的。第三, 立体定向技术需要精确定位在鲍曼的空间的移液器在三维度, 在肾脏表面下高达100µm。因此, 注册移液器的坐标系和精确的阶段是关键步骤。第四, 仔细选择目标肾小球是必要的, 以确保它是可供移液器不受肾脏支持结构和成像柱的冲击。最后, 必须仔细考虑采取的分析步骤, 以遵循采集程序, 流体样品的采集量和时间必须与分析和肾小球生理学相匹配。
我们设计了一种可扩展到许多分析的采集程序, 包括传统的微穿刺端点, 例如火焰光度法、离子敏感电极测量或压力、体积或电荷测量。此外, 我们相信这项技术将适用于新的分析终点, 包括聚合酶链反应 (可能跟随 miRNA 的反转转录) 和质谱下游的代谢组学。用于促进质谱的特殊修改值得进一步讨论, 它们也施加一些限制。首先, 虽然质谱是高度敏感的, 微穿刺样本的低蛋白质含量和体积使蛋白质分析在常规蛋白质组探索的动态范围之下, 因此简化 nanoproteomics必要。8,13秒为了优化早期检测的蛋白质产量, 我们确定了 200-300 nL 的吸液是必要的, 但对于这个体积的全新滤液采集, 如果鼠标 GFR 仅为 8-14 nL, 则可能需要长达20分钟的吸入。/分钟3。随着哉和小管显示, 长时间的吸入改变了早期近端小管液的白蛋白含量14, 我们选择吸6分钟以上;然而, 这意味着我们的吸入率超过滤液流入率。在设计工作流程时, 鼓励用户在实验系统中考虑肾小球过滤的生理学。质谱是一种敏感的技术, 它会被引进的石油馏分 (如矿物油) 的信号所淹没, 微穿刺通常用于保留肾单位的吸水和隔离段的液压系统。因此, 我们不能将矿物油用于此目的, 或它的其他共同用途, 量化纳升范围样品的体积。相反, 我们用生物惰性的对眼填充系统, 不干扰质谱, 具有良好的光学特性。我们相信对眼所施加的限制是可以克服的, 并正在研究更多的技术创新, 我们预计将允许测量样品体积和管状段的封锁。
大多数微穿刺的研究都是在慕尼黑大鼠身上进行的, 它显示了表面肾小球的增加, 但由于基本的丧失, 这大大限制了管状运输和其他肾脏生理学的生理研究。分子生物学工具, 转基因小鼠2,3。由于它便于微量吸管访问鲍曼的小鼠空间, 因此新的技术可以减轻这些严重的局限性。我们采用这种技术, 以获得肾脏滤液的蛋白质组研究使用高灵敏度质谱法, 称为 nanoproteomics9。但是, 可能还有其他应用程序。例如, 使用2光子显微术15、16、17的荧光示踪剂, 大大帮助过滤蛋白的肾脏生理学研究。添加微穿刺到2光子显微镜提供了使用荧光分子进行单保留肾单位生理研究的可能性, 允许相邻的, 非注入 nephrons 作为控制。希望这一明确的解释, 必要的步骤将允许广泛采用的实验室已经配备了2光子显微镜和/或微穿刺。虽然它是复杂的, 我们现在已经执行这个过程很多次, 这里提出的改进代表了一个稳定的生理发现平台。
The authors have nothing to disclose.
NIDDKK08 DK090754 到每小时研究院P41 GM103493 到RDS。该材料是由波特兰退伍军人事务医疗中心的资源和设施所支持的工作成果 (按 MPH)。内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的意见。
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |