Vi præsenterer anvendelse af 2-foton mikroskopi til at placere en mikropipette inden for Bowmans urin plads i mus, kombinere 2 grundlagsforskning teknikker af renal fysiologi. Anvendelse af 2-foton mikroskopi overvinder kritiske begrænsninger af konventionelle mikroskopi for micropuncture renal fysiologi undersøgelser.
Nyre micropuncture og renal 2-foton imaging er skelsættende teknikker i renal fysiologi. Men micropuncture er begrænset af afhængighed af konventionelle mikroskopi til overflade nephron funktioner, og 2-foton undersøgelser er begrænset i, at interventioner kan kun vurderes på orgel, snarere end nephron plan. Især er micropuncture studier af glomeruli af mus blevet anfægtet af sparsomme overflade glomeruli i mus. For at afhjælpe denne begrænsning for at fortsætte studier af aspirat fra Bowmans plads i mus fysiologiske modeller, udviklet vi 2-foton glomerulær micropuncture. Vi præsenterer en roman kirurgisk forberedelse, der giver mulighed for lateral adgang til nyrerne samtidig bevare den nødvendige imaging vertikalsøjlen for 2-foton mikroskopi. Administration af høj molekylvægt fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran bruges til at gengive renal vaskulatur og derfor glomeruli synlige for 2-foton imaging. Quantum dot-belagt pipette er derefter indført under stereotactic vejledning til en glomerulus valgt fra flere mange som kan visualiseres i vinduet billeddannelse. I denne protokol give vi oplysninger til forberedelse, materialer og metoder, der er nødvendige for at gennemføre proceduren. Denne teknik letter tidligere umuligt fysiologisk undersøgelse af nyrerne, herunder genopretning af filtratet fra Bowmans plads og alle segmenter af nephron for billedbehandling dybdegrænse, ca. 100 µm nedenfor den renale kapsel. Pres, afgift og flow kan alle måles ved hjælp af den indførte pipette. Her give vi repræsentative data fra flydende kromatografi/massespektrometri udføres på aspirat fra Bowmans plads. Vi forventer, at denne teknik at have bred anvendelighed i renal fysiologisk undersøgelse.
Formålet med denne fremgangsmåde er at give rutine micropuncture adgang til Bowmans plads og andre glomerulær strukturer i mus. Micropuncture undersøgelser for renal fysiologi har været begrænset til 1-foton mikroskopi, som kan kun billedet inden for nogle få mikrometer af nyre overflade, og som tilbyder begrænset præcision i z-dimension. Fordi mus har par overflade glomeruli, det er ikke altid muligt at finde en overflade glomerulus af 1-foton mikroskopi, derfor de fleste micropuncture undersøgelser er blevet udført i München-Wistar rotter, som har mere talrige overflade glomeruli. Derfor, fordelene ved arbejder i musemodeller har været begrænset i micropuncture undersøgelser1,2,3. De seneste fremskridt i imaging-teknologier, herunder mikro-CT4,5, nanopartikel imaging6, og imaging massespektrometri7 har stærkt forbedret rækken af retningslinjer for glomerulær fysiologi, men der er stadig ingen erstatning for den unikke evne til at gribe ind og prøve at micropuncture giver. Derfor udvidet anvendelse af micropuncture ved hjælp af de teknikker præsenteret her forventes at lette roman renal fysiologi undersøgelser, i særdeleshed evaluering af indholdet af renal filtratet (dvs., metabolomics) og grundlæggende fysiologi Transgene mus, såsom målinger af filtratet pres og afgift, tidligere udføres kun i rotter.
I denne teknik tillader anvendelse af 2-foton mikroskopi visualisering og mikropipette adgang til renal strukturer op til omkring 100 µm nedenfor den renale kapsel. Flere (5 – 10) glomeruli er derfor tilgængelig for micropuncture i hver musenyre hidtil afbildet. Selv om denne teknik deler nogle funktioner med konventionelle renal micropuncture, det var designet de novo og omfattende ændringer fra konventionel teknik er påkrævet. I denne protokol vi demonstrere aspiration af væske fra Bowmans plads og Vis eksempel resultaterne af efterfølgende analyse med massespektrometri (nanoproteomics)8,9,10,11. Downstream anvendelsen af massespektrometri kræver en specialiseret prøve forberedelse arbejdsproces, der er også vist her.
Vi præsenterer en metode til at få adgang til Bowmans plads af ikke-overflade glomeruli i mus, lettes ved 2-foton mikroskopi. Vi udviklede denne procedure for at løse en afgørende begrænsning af glomerulær micropuncture, sjældenhed af overflade glomeruli adresseres af 1-foton mikroskopi i mus, for at lette en eksperimentel mål, aspiration af væske fra Bowmans plads til efterfølgende analyse. Udvikling og praksis af denne teknik hviler på seks kritiske trin. Først, den nye kirurgiske forberedelse omhyggeligt foretages således at billeddannelse vandsøjlen kører ikke ud af coverslip og coverslip strækker sig over området i nyrerne, som er målet for pipetten. For det andet skal glas pipette bruges til micropuncture gengives synlige for 2-foton mikroskopi, som er udført ved hjælp af quantum dots. Tredje, stereotactic teknik er forpligtet til at netop placere en pipette i Bowmans plads i tre dimensioner, op til 100 µm under nyre overflade. Derfor, registrering koordinatsystemer pipetten og scenen med præcision er kritiske trin. Fjerde, omhyggelig udvælgelse af mål glomerulus er nødvendige for at sikre, at det er tilgængeligt for pipette uden impingement ved nyre støttestruktur og billedbehandling kolonne. Endelig nøje overvejelser skal gives til de analytiske trin til at følge proceduren for erhvervelse og volumen og tidsplanen for erhvervelse af flydende prøver skal modsvares at analysen og glomerulær fysiologi.
Vi designede en erhvervelse procedure, der kan udvides til mange analyser, herunder traditionelle micropuncture slutpunkter, som flammen fotometri, ion-følsomme elektrode målinger eller målinger af tryk, volumen eller afgift. Derudover mener vi, denne teknik vil være åbne over for nye analytiske slutpunkter herunder polymerase kædereaktion (måske efter reverse transkription for miRNA) og metabolomics nedstrøms af massespektrometri. De særlige ændringer ansat til at lette massespektrometri fortjener yderligere diskussion, og de indfører nogle begrænsninger. Først, selv om massespektrometri er meget følsomme, lavt proteinindhold og volumen af micropuncture prøver gengiver analyse af protein under det dynamiske område af konventionelle proteom udforskning, og derfor forenklet nanoproteomics blev nødvendige. 8 , 13 det andet for at optimere protein udbytte for tidlige assays, vi besluttet, at 200-300 nL af aspirat var nødvendige, men de novo filtratet erhvervelse af diskenheden kræver måske så længe som 20 minutter af aspiration hvis musen GFR er kun 8-14 nL /min3. Tojo og Endou bevist at langvarig aspiration ændrer albumin indholdet af tidlige proksimale tubulus væske14, valgt vi Aspirér over 6 minutter; men dette betyder, at vores aspiration sats overstiger filtratet indstrømning sats. Brugere af denne procedure opfordres til at overveje fysiologi af glomerulær filtration i deres eksperimentel system i at designe deres arbejdsproces. Massespektrometri, en følsom teknik, vil blive overvældet af signalet fra en indført petroleum destillat såsom mineralsk olie, som er almindeligt anvendt i micropuncture til at omfatte det hydrauliske system for aspiration og isolere segmenter af nephron. Derfor, vi kunne ikke bruge mineralsk olie til dette formål, eller dets andre fælles bruger, kvantificering af mængden af nanoliter udvalg prøver. I stedet, vi fylder systemet med perfluorodecalin, som er biologisk inaktivt, ikke forstyrrer massespektrometri og har positiv optiske egenskaber. Vi mener de begrænsninger af perfluorodecalin overvindes og arbejder på yderligere tekniske nyskabelser, som vi forventer vil muliggøre måling af sample volumen og blokaden af de rørformede segment.
De fleste micropuncture undersøgelser har været udført i München-Wistar rotter, som viser øget antal overflade glomeruli, men denne meget begrænset fysiologisk undersøgelse af rørformede transport og andre renal fysiologi på grund af tabet af grundlæggende værktøj af molecular biology, Transgene mus2,3. Fordi det letter mikropipette adgang til Bowmans plads i mus, afbøder den roman teknik derfor disse kritiske begrænsninger. Vi vedtog denne teknik for at få adgang til renal filtratet for proteom undersøgelser med høj følsomhed massespektrometri, kendt som nanoproteomics9. Der er dog sandsynligvis yderligere programmer. For eksempel, har renal fysiologisk undersøgelse af filtrerede protein været stærkt hjulpet af brug af fluorescerende sporstoffer med 2-foton mikroskopi15,16,17. Tilsætning af micropuncture til 2-foton mikroskopi giver mulighed for at udføre single-nephron fysiologisk undersøgelse med fluorescerende molekyler, så nærliggende, ikke-indsprøjtning nephrons til at tjene som kontrol. Det er håbet, at denne klar forklaring af de nødvendige foranstaltninger vil give bred vedtagelsen i labs allerede udstyret til 2-foton mikroskopi og/eller micropuncture. Selv om det er kompleks, vi nu har udført denne procedure mange gange og de justeringer, der præsenteres heri udgør en stabil platform for fysiologisk opdagelse.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 til MPH. NIGMS P41 GM103493 RDS. Dette materiale er resultatet af arbejde (af MPH), der blev støttet med midler og brug af faciliteterne på Portland veteraner anliggender Medical Center. Oplysningerne repræsenterer ikke synspunkter US Department of veterananliggender eller de Forenede Staters regering.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |