हम 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के लिए चूहों में बोमन मूत्र अंतरिक्ष के भीतर एक micropipette जगह है, गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान के 2 मूलभूत तकनीकों के संयोजन. 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग micropuncture गुर्दे फिजियोलॉजी अध्ययन के लिए पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की महत्वपूर्ण सीमाओं पर काबू ।
गुर्दे micropuncture और गुर्दे 2-फोटॉन इमेजिंग गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान में लाभदायक तकनीक हैं । हालांकि, micropuncture पारंपरिक माइक्रोस्कोपी पर निर्भरता nephron सुविधाओं की सतह के लिए सीमित है, और 2-फोटॉन अध्ययन में सीमित है कि हस्तक्षेप केवल अंग पर मूल्यांकन किया जा सकता है, बजाय nephron स्तर । विशेष रूप से चूहों के glomeruli के micropuncture अध्ययनों को चूहों में सतह glomeruli की धनाभाव से चुनौती दी गई है. इस सीमा का पता करने के लिए माउस शारीरिक मॉडल में है बोमन अंतरिक्ष से महाप्राण के अध्ययन का पीछा करने के लिए, हम 2 विकसित-फोटॉन glomerular micropuncture । हम 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक ऊर्ध्वाधर इमेजिंग कॉलम के संरक्षण, जबकि गुर्दे के लिए पार्श्व का उपयोग की अनुमति देता है कि एक उपंयास शल्य तैयारी प्रस्तुत करते हैं । उच्च आणविक भार fluorescein isothiocyanate (FITC) के प्रशासन-dextran गुर्दे vasculature और इसलिए 2-glomeruli इमेजिंग के लिए दिखाई फोटॉन प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक क्वांटम डॉट लेपित पिपेट तो स्टीरियोटैक्टिक मार्गदर्शन के तहत एक कई जो इमेजिंग विंडो के भीतर visualized किया जा सकता है कई से चयनित glomerulus के लिए शुरू की है । इस प्रोटोकॉल में, हम तैयारी, सामग्री, और प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक तरीकों का विवरण प्रदान करते हैं । इस तकनीक के पहले-असंभव शारीरिक अध्ययन की सुविधा, बोमन की अंतरिक्ष से निस्पंदन की वसूली सहित और इमेजिंग गहराई सीमा के भीतर nephron के सभी क्षेत्रों, गुर्दे कैप्सूल के बारे में १०० µm के नीचे. दबाव, चार्ज और प्रवाह सभी शुरू पिपेट का उपयोग कर मापा जा सकता है । यहां, हम तरल क्रोमैटोग्राफी/जन स्पेक्ट्रोमेट्री से प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते है बोमन अंतरिक्ष से महाप्राण पर प्रदर्शन किया । हम इस तकनीक गुर्दे शारीरिक जांच में व्यापक प्रयोज्यता की उंमीद है ।
इस प्रक्रिया का उद्देश्य है बोमन अंतरिक्ष और चूहों में अन्य glomerular संरचनाओं के लिए नियमित micropuncture पहुँच प्रदान करना है. गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान के लिए Micropuncture अध्ययन 1-फोटॉन माइक्रोस्कोपी करने के लिए सीमित किया गया है, जो केवल गुर्दे की सतह के कुछ माइक्रोन के भीतर छवि कर सकते हैं, और जो z-आयाम में सीमित परिशुद्धता प्रदान करता है. क्योंकि चूहों कुछ सतह glomeruli है, यह हमेशा संभव नहीं है एक सतह glomerulus द्वारा खोजने के लिए 1-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, इसलिए सबसे micropuncture अध्ययन किया गया है ंयूनिख-Wistar चूहों, जो और अधिक कई सतह glomeruli है. इसलिए, माउस मॉडल में काम करने का लाभ micropuncture अध्ययन1,2,3में सीमित किया गया है । इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में हाल ही में अग्रिमों, माइक्रो सीटी सहित4,5, nanoparticle इमेजिंग6, और इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री7 बहुत glomerular फिजियोलॉजी के लिए लागू मोडलों की सीमा को बढ़ाया है, लेकिन वहां अद्वितीय हस्तक्षेप करने की क्षमता और नमूना है कि micropuncture प्रदान करता है के लिए कोई विकल्प नहीं है । इसलिए micropuncture के उपयोग का विस्तार यहां प्रस्तुत तकनीकों का उपयोग करने के लिए उपंयास गुर्दे फिजियोलॉजी अध्ययन की सुविधा की उंमीद है, विशेष रूप से, गुर्दे निस्पंदन की सामग्री का मूल्यांकन (यानी, metabolomics) और बुनियादी शरीर क्रिया विज्ञान के ट्रांसजेनिक चूहों, ऐसे छानने का दबाव और आरोप की माप के रूप में, पहले ही चूहों में प्रदर्शन किया.
इस तकनीक में, 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के प्रयोग से गुर्दे की कैप्सूल नीचे के बारे में १०० µm करने के लिए गुर्दा संरचनाओं के लिए दृश्य और micropipette का उपयोग की अनुमति देता है । एकाधिक (5-10) glomeruli इसलिए हर माउस गुर्दे इस प्रकार अब तक छवि में micropuncture के लिए सुलभ हैं । हालांकि यह तकनीक पारंपरिक गुर्दे micropuncture के साथ कुछ सुविधाओं के शेयरों, यह de नोवो और पारंपरिक तकनीक से व्यापक संशोधनों के डिजाइन किया गया है की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल में हम है बोमन अंतरिक्ष और शो मास स्पेक्ट्रोमेट्री (nanoproteomics)8,9,10,11के साथ बाद विश्लेषण के उदाहरण के परिणाम से द्रव की आकांक्षा का प्रदर्शन । जन स्पेक्ट्रोमेट्री के बहाव का उपयोग एक विशेष नमूना तैयारी कार्यप्रवाह है, जो भी यहां का प्रदर्शन किया है की आवश्यकता है ।
हम चूहों में गैर सतह glomeruli के बोमन अंतरिक्ष का उपयोग करने के लिए एक विधि पेश करते हैं, 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सुविधा. हम इस प्रक्रिया को विकसित करने के लिए glomerular micropuncture की एक प्रमुख सीमा का पता, सतह glomeruli के दुर्लभ वस्तु 1-चूहों में फोटॉन माइक्रोस्कोपी, क्रम में एक प्रयोगात्मक उद्देश्य की सुविधा के लिए, है बोमन अंतरिक्ष से द्रव की आकांक्षा बाद में विश्लेषण । विकास और इस तकनीक का अभ्यास छह महत्वपूर्ण कदम पर टिकी हुई है । सबसे पहले, उपंयास शल्य तैयारी सावधानी से किया जाना चाहिए ताकि इमेजिंग पानी स्तंभ बंद coverslip और coverslip गुर्दे के क्षेत्र में फैली हुई है जो पिपेट का लक्ष्य है पर नहीं चलता है । दूसरा, कांच micropuncture के लिए इस्तेमाल पिपेट 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, जो क्वांटम डॉट्स का उपयोग कर पूरा किया जाता है के लिए दृश्यमान होना चाहिए । तीसरे, स्टीरियोटैक्टिक तकनीक को ठीक तीन आयामों में है बोमन अंतरिक्ष में एक पिपेट की स्थिति के लिए आवश्यक है, ऊपर १०० µm गुर्दे की सतह के नीचे । इसलिए, पिपेट और परिशुद्धता के साथ मंच के समंवय प्रणालियों पंजीकरण महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । चौथा, सावधान लक्ष्य glomerulus के चयन यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि यह गुर्दे की सहायता संरचना और इमेजिंग कॉलम द्वारा भिडंत के बिना पिपेट के लिए सुलभ है । अंत में, सावधान विचार विश्लेषणात्मक कदम के लिए अधिग्रहण की प्रक्रिया का पालन करने के लिए दिया जाना चाहिए, और मात्रा और तरल पदार्थ के नमूने के अधिग्रहण के समय विश्लेषण और glomerular फिजियोलॉजी के लिए मिलान किया जाना चाहिए ।
हम एक अधिग्रहण प्रक्रिया है कि पारंपरिक micropuncture अंतिमबिंदु, जैसे लौ photometry, आयन के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड माप, या दबाव, मात्रा या शुल्क की माप सहित कई विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है बनाया है । इसके अतिरिक्त, हमें विश्वास है कि इस तकनीक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया सहित विश्लेषणात्मक अंतिमबिंदु के लिए उत्तरदायी होगा (शायद miRNA के लिए रिवर्स प्रतिलेखन के बाद) और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के metabolomics बहाव. विशेष को जन स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए कार्यरत संशोधनों अतिरिक्त चर्चा के लायक है, और वे कुछ सीमाएं लागू । सबसे पहले, हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री अति संवेदनशील है, कम प्रोटीन सामग्री और micropuncture नमूनों की मात्रा पारंपरिक proteomic अंवेषण के गतिशील रेंज के नीचे प्रोटीन का विश्लेषण प्रदान करता है, और इसलिए सरलीकृत nanoproteomics थे आवश्यक. 8 , 13 दूसरा, जल्दी परख के लिए प्रोटीन उपज का अनुकूलन, हम निर्धारित किया है कि महाप्राण के 200-300 nL आवश्यक था, लेकिन de नोवो इस खंड के अधिग्रहण की आवश्यकता होती है शायद के रूप में आकांक्षा के 20 मिनट के रूप में लंबे समय के रूप में अगर माउस GFR केवल 8-14 है nL लैंडलाइंस3. के रूप में तोजो और Endou का प्रदर्शन किया है कि लंबे समय तक आकांक्षा जल्दी समीपस्थ tubule द्रव14की एल्ब्युमिन सामग्री बदल, हम 6 मिनट से अधिक महाप्राण के लिए चुने गए; लेकिन इसका मतलब यह है कि हमारी आकांक्षा दर निस्पंदन प्रवाह की दर से अधिक है । इस प्रक्रिया के उपयोगकर्ताओं को उनके कार्यप्रवाह डिजाइनिंग में उनके प्रायोगिक प्रणाली में glomerular निस्पंदन के फिजियोलॉजी पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एक संवेदनशील तकनीक, खनिज तेल, जो सामांयतः micropuncture में प्रयोग किया जाता है आकांक्षा और nephron के क्षेत्रों को अलग करने के लिए हाइड्रोलिक प्रणाली शामिल करने के रूप में एक शुरू की पेट्रोलियम आसुत से संकेत से अभिभूत हो जाएगा । इसलिए, हम इस प्रयोजन के लिए खनिज तेल का उपयोग नहीं, या इसके अंय आम उपयोग करते हैं, nanoliter रेंज के नमूनों की मात्रा का ठहराव सकता है । इसके बजाय हम perfluorodecalin जो जैविक रूप से निष्क्रिय है के साथ प्रणाली को भरने, जन स्पेक्ट्रोमेट्री परेशान नहीं करता है, और अनुकूल ऑप्टिकल विशेषताओं है । हमारा मानना है कि perfluorodecalin द्वारा लगाई गई सीमाएं दुर्गम हैं और अतिरिक्त तकनीकी नवाचारों पर काम कर रहे हैं जो हमें उम्मीद है कि नमूना मात्रा और ट्यूबलर खंड की नाकेबंदी का माप होगा ।
सबसे micropuncture अध्ययन ंयूनिख-Wistar चूहों, जो सतह glomeruli की संख्या में वृद्धि का प्रदर्शन में प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यह बहुत सीमित ट्यूबलर परिवहन और अंय गुर्दे फिजियोलॉजी के शारीरिक अध्ययन क्योंकि मौलिक के नुकसान की आण्विक जीवविज्ञान के उपकरण, ट्रांसजेनिक2चूहों,3। क्योंकि यह चूहों में बोमन अंतरिक्ष के लिए micropipette पहुंच की सुविधा, उपंयास तकनीक इसलिए इन महत्वपूर्ण सीमाओं का शमन । हम nanoproteomics9के रूप में जाना उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमेट्री, का उपयोग कर proteomic अध्ययन के लिए गुर्दे निस्पंदन उपयोग करने के क्रम में इस तकनीक को अपनाया । हालांकि, संभव है कि अतिरिक्त अनुप्रयोग हैं । उदाहरण के लिए, फ़िल्टर किए गए प्रोटीन के गुर्दे शारीरिक अध्ययन बहुत 2 के साथ फ्लोरोसेंट अनुरेखक के उपयोग से सहायता प्राप्त किया गया है-फोटॉन माइक्रोस्कोपी15,16,17. micropuncture के अलावा 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ एकल-nephron शारीरिक अध्ययन प्रदर्शन की संभावना प्रदान करता है, पड़ोसी की अनुमति, गैर इंजेक्शन बिगडते नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए । यह आशा व्यक्त की है कि आवश्यक कदम के इस स्पष्ट विवरण पहले से ही 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और/micropuncture के लिए सुसज्जित प्रयोगशालाओं में व्यापक गोद लेने की अनुमति देगा । हालांकि यह जटिल है, हम अब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है कई बार और शोधन प्रस्तुत यहां शारीरिक खोज के लिए एक स्थिर मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 से मील प्रति घंटे तक. NIGMS P41 GM103493 को आरडीएस. इस सामग्री के काम का परिणाम है (मील प्रति घंटा) जो संसाधनों और पोर्टलैंड दिग्गजों मामलों चिकित्सा केंद्र में सुविधाओं के उपयोग के साथ समर्थित किया गया था । सामग्री के दिग्गजों मामलों या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के अमेरिकी विभाग के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते ।
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |