Vi presentiamo uso di microscopia di 2 fotoni per posizionare una micropipetta all’interno dello spazio urinario di Bowman in topi, che unisce 2 tecniche fondamentali della fisiologia renale. Uso di microscopia di 2 fotoni supera i limiti critici di microscopia convenzionale per micropuntura studi di fisiologia renale.
Micropuntura renale e la formazione immagine renale 2 fotoni sono tecniche seminale in fisiologia renale. Tuttavia, micropuntura è limitata dalla dipendenza da microscopia convenzionale alle caratteristiche superficiali del nefrone e studi 2-fotone sono limitati in quanto gli interventi possono essere valutati soltanto presso l’organo, piuttosto che il livello del nefrone. In particolare, Micropuntura studi dei glomeruli dei topi sono stati contestati dalla scarsità di superficie dei glomeruli in topi. Per risolvere questa limitazione al fine di perseguire gli studi dell’aspirato dallo spazio di Bowman in modelli murini di fisiologica, abbiamo sviluppato 2-fotone micropuntura glomerulare. Vi presentiamo una romanzo preparazione chirurgica che consente l’accesso laterale al rene, preservando la colonna verticale richiesta di imaging per microscopia 2-fotone. Amministrazione di alto peso molecolare isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano è usato per rendere il sistema vascolare renale e quindi dei glomeruli visibili immagini 2-fotone. Una pipetta di quantum dot-rivestito è quindi introdotto sotto guida stereotassica per un glomerulo selezionato da molti a molti che possono essere visualizzati all’interno della finestra di imaging. In questo protocollo, forniamo dettagli della preparazione, materiali e metodi necessari per eseguire la procedura. Questa tecnica facilita in precedenza impossibili studio fisiologico del rene, compreso il recupero del filtrato dallo spazio di Bowman e tutti i segmenti del nefrone entro il limite di profondità imaging, circa 100 µm sotto la capsula renale. Pressione, di carica e di flusso possono tutti essere misurati utilizzando la pipetta introdotta. Qui, forniamo dati rappresentativi da liquida cromatografia/spettrometria di massa eseguita su aspirato dallo spazio di Bowman. Ci aspettiamo che questa tecnica per avere ampia applicabilità nell’inchiesta fisiologica renale.
Lo scopo di questa procedura è quello di fornire routine micropuntura accesso allo spazio di Bowman e altre strutture glomerulari in topi. Micropuntura studi per fisiologia renale sono stati limitati a 1-fotone microscopia, che può solo l’immagine all’interno di pochi micron della superficie del rene, e che offre precisione limitata nella dimensione z. Perché i topi hanno pochi glomeruli di superficie, non è sempre possibile trovare un glomerulo superficie da microscopia 1-fotone, quindi maggior parte Micropuntura studi effettuati nei ratti di Munich-Wistar, che sono più numerosi dei glomeruli superficiali. Di conseguenza, i vantaggi di lavorare in modelli murini sono stati limitati in Micropuntura studi1,2,3. Gli avanzamenti recenti nella formazione immagine di tecnologie, tra cui micro-CT4,5, nanoparticelle imaging6e imaging spettrometria totale7 notevolmente hanno aumentato la gamma di modalità applicabili alla fisiologia glomerulare, ma C’è ancora nessun sostituto per l’unica possibilità di intervenire e assaggiare quel micropuntura offre. Quindi estendere l’uso di micropuntura utilizzando le tecniche qui presentate dovrebbe facilitare studi di fisiologia renale romanzo, in particolare, valutazione del contenuto del filtrato renale (cioè, metabolomica) e fisiologia di base di topi transgenici, quali misure di pressione filtrato e carica, precedentemente svolti solo nei ratti.
In questa tecnica, uso di 2 fotoni microscopia consente la visualizzazione e accesso micropipetta a strutture renali fino a circa 100 µm sotto la capsula renale. Multiple (5 – 10) glomeruli sono pertanto accessibili a micropuntura in ogni rene del topo finora imaged. Sebbene questa tecnica condivide alcune caratteristiche con micropuntura renale convenzionale, è stato progettato de novo e profonde modifiche da tecnica convenzionale sono necessari. In questo protocollo dimostriamo aspirazione di liquido dallo spazio di Bowman e Visualizza esempio risultati di successiva analisi con spettrometria di massa (nanoproteomics)8,9,10,11. Uso a valle della spettrometria di massa richiede un flusso di lavoro di preparazione di campione specializzati, che si è dimostrato anche qui.
Presentiamo un metodo per accedere allo spazio di Bowman dei glomeruli non superficiali nei topi, facilitati dalla microscopia 2-fotone. Abbiamo sviluppato questa procedura per risolvere una limitazione chiave di micropuntura glomerulare, la rarità dei glomeruli superficie indirizzabili tramite microscopia 1-fotone in topi, al fine di agevolare un obiettivo sperimentale, aspirazione di liquido dallo spazio di Bowman per analisi successiva. Sviluppo e pratica di questa tecnica si basa su sei fasi critiche. In primo luogo, il romanzo preparazione chirurgica deve essere accuratamente effettuata affinché la colonna d’acqua imaging non colano il vetrino coprioggetto e il vetrino coprioggetti si estende sopra la zona del rene che è l’obiettivo della pipetta. In secondo luogo, la pipetta di vetro utilizzata per micropuntura deve essere reso visibile per microscopia 2-fotone, che avviene utilizzando punti quantici. Terzo, stereotactic tecnica è necessaria per posizionare con precisione una pipetta nello spazio di Bowman in tre dimensioni, fino a 100 µm sotto la superficie del rene. Pertanto, i sistemi di coordinate della pipetta e la fase di registrazione con precisione sono passaggi critici. In quarto luogo, un’attenta selezione del glomerulo destinazione è necessario garantire che è accessibile per la pipetta senza urto dalla struttura di supporto del rene e imaging colonna. Infine, un’attenta considerazione deve essere data alla procedura analitica di seguire la procedura di acquisizione, e volume e tempi di acquisizione di campioni di fluido deve essere adeguate all’analisi e alla fisiologia glomerulare.
Abbiamo progettato una procedura di acquisizione che può essere estesa a molte analisi, inclusi gli endpoint micropuntura tradizionali, come la fotometria di fiamma, degli elettrodi sensibili agli ioni misure o misure di pressione, di volume o di carica. Inoltre, riteniamo che questa tecnica sarà suscettibile di nuovi endpoint analitico tra cui reazione a catena della polimerasi (forse dopo trascrizione inversa per miRNA) e metabolomica a valle della spettrometria di massa. Le modifiche speciali impiegate per facilitare la spettrometria di massa meritano discussione supplementare, e imporre alcune limitazioni. In primo luogo, sebbene spettrometria di massa è altamente sensibile, il basso contenuto di proteine e il volume dei campioni di micropuntura esegue il rendering di analisi della proteina sotto la gamma dinamica di esplorazione di proteomica convenzionale, e quindi erano nanoproteomics semplificato necessarie. 8 , 13 in secondo luogo, per ottimizzare la resa di proteina per primi saggi, abbiamo determinato che 200-300 nL dell’aspirato era necessaria, ma de novo filtrato acquisizione di questo volume richiederebbe forse fino a 20 minuti di aspirazione se il mouse GFR è solo 8-14 nL / min3. Come Tojo ed Endou ha dimostrato che la prolungata aspirazione altera il contenuto di albumina di fluido iniziali del tubulo prossimale14, abbiamo eletto per aspirare oltre 6 minuti; Tuttavia, questo significa che il nostro tasso di aspirazione supera il tasso di afflusso di filtrato. Gli utenti di questa procedura sono incoraggiati a prendere in considerazione la fisiologia di filtrazione glomerulare nel loro sistema sperimentale in progettazione loro flusso di lavoro. Spettrometria di massa, una tecnica sensibile, sarebbe essere sopraffatto dal segnale proveniente da un distillato di petrolio introdotto come l’olio minerale, che è comunemente usato in micropuntura costituiscono il sistema idraulico per l’aspirazione e isolare i segmenti del nefrone. Pertanto, non abbiamo potuto utilizzare olio minerale per questo scopo, o altri suo comune utilizzare, quantificazione del volume di campioni range nanolitro. Invece abbiamo riempire l’impianto con perfluorodecalina che è biologicamente inerte, non interferisce con la spettrometria di massa e ha favorevoli caratteristiche ottiche. Crediamo che le limitazioni imposte dal perfluorodecalina sono surmountable e stanno lavorando su ulteriori innovazioni tecniche che ci aspettiamo che vi permetterà di misurazione del volume di campione e blocco del segmento tubolare.
La maggior parte Micropuntura studi sono stati condotti in ratti Wistar Munich, che dimostrano i numeri aumentati dei glomeruli superficiali, ma questo studio fisiologico notevolmente limitato di trasporto tubulare e altri fisiologia renale a causa della perdita della fondamentale strumento di biologia molecolare, topi transgenici2,3. Perché facilita l’accesso allo spazio di Bowman in topi micropipetta, la tecnica novella pertanto attenua questi limiti critici. Abbiamo adottato questa tecnica per poter accedere a renale filtrato per studi di proteomica mediante spettrometria di massa ad alta sensibilità, nota come nanoproteomics9. Tuttavia, ci sono probabili ulteriori domande. Ad esempio, studio renale fisiologica della proteina filtrata è stata notevolmente facilitata da uso di traccianti fluorescenti con microscopia 2-fotone15,16,17. Aggiunta di micropuntura alla microscopia a 2 fotoni offre la possibilità di eseguire uno studio fisiologico del singolo-nefrone con molecole fluorescenti, permettendo di nefroni vicini, non-iniettato servire da comandi. Si spera che questa spiegazione chiara delle misure necessarie permetterà ampia adozione in laboratori già attrezzati per 2-fotone microscopia e/o micropuntura. Anche se è complesso, ora abbiamo effettuato questa procedura tutte le volte e le raffinatezze presentate qui rappresentano una piattaforma stabile per scoperta fisiologica.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 di NIGMS MPH. P41 GM103493 a RDS. Questo materiale è il risultato del lavoro (da MPH) che è stata sostenuta con le risorse e l’uso di Servizi Portland Veterans Affairs Medical Center. I contenuti non rappresentano le opinioni di l’US Department of Veterans Affairs o di governo degli Stati Uniti.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |