Dynamisk vedhæftning af immunceller til karvæggen er en forudsætning for gut målsøgende. Her præsenterer vi en protokol til en funktionel i vitro assay for konsekvensanalyse af anti-integrin antistoffer, kemokiner eller andre faktorer på den dynamiske celle vedhæftning af menneskelige celler ved hjælp af addressin-belagt kapillærer.
Gut homing af immunceller er vigtigt for patogenesen af inflammatoriske tarmsygdomme (IBD). Integra-afhængige celle vedhæftning til addressins er et afgørende skridt i denne proces og terapeutiske strategier forstyrrer vedhæftning har været med succes etableret. Anti-α4β7 integrin antistof, vedolizumab, der bruges til den kliniske behandling af Crohns sygdom (CD) og colitis ulcerosa (UC) og yderligere forbindelser er tilbøjelige til at følge.
Nærmere oplysninger om proceduren vedhæftning og handling mekanismer for anti-integrin antistoffer er stadig uklart i mange henseender på grund af den begrænsede tilgængelige teknik for den funktionelle forskning på dette område.
Her præsenterer vi en dynamisk friktionskoefficient assay for den funktionelle analyse af humane celle vedhæftning flow betingelser og virkningen af anti-integrin behandlingsformer i forbindelse med IBD. Det er baseret på perfusion af primære menneskelige celler gennem addressin-belagt ultratynde glas kapillærer med real-time mikroskopisk analyse. Analysen tilbyder en bred vifte af muligheder for forbedringer og ændringer og holder potentialer for mekanistisk opdagelser og translationel applikationer.
Celle bevægelse er en stramt reguleret proces uundværlige for udvikling og funktion af multi-cellulære organismer, men er også involveret i patogenesen af en lang række sygdomme1. For nylig, den homing proces af immunceller fra blodet til de perifere væv har fået stigende opmærksomhed, da det bidrager til genbestilling og udvidelse af sygdomsfremkaldende celler i betændt væv i immunologisk medierede sygdomme2 ,3. Især har homing vist sig at have translationel relevans i inflammatoriske tarmsygdomme (IBD). Den terapeutiske anti-α4β7 integrin antistof vedolizumab forstyrrer gut homing har vist effekt i store kliniske forsøg4,5 og held har været anvendt i virkelige verden klinisk praksis6,7 , 8. yderligere forbindelser er tilbøjelige til at følge9,10. Ligeledes, den terapeutiske anti-α4-integrin antistof, natalizumab, bruges til behandling af multipel sklerose (MS)11.
Men vores funktionel forståelse af målsøgende processen i almindelighed og virkningsmekanisme af sådanne terapeutiske antistoffer i særdeleshed er stadig begrænset. Det er godt etableret, målsøgende består af flere trin, herunder celle tøjring og rullende med efterfølgende celle vedhæftning fører til fast anholdelse efterfulgt af trans endotel migration12,13. De ovennævnte antistoffer neutralisere integriner på cellens overflade forhindrer interaktion med addressins på endotelet i karvæggen. Dette menes at hæmme fast celle vedhæftning14,15. Endnu, vi kun begyndt at forstå differential relevansen af specifikke integriner for celle homing af særskilt celle subsets. Desuden virkningerne af anti-integrin antistoffer på forskellige celle subsets og dosis-respons foreninger er stort set ukendt, fører til masser af åbne spørgsmål inden for gut målsøgende og anti-friktion behandlingsformer i IBD.
Derfor er der desperat behov for praktiske værktøjer til at løse sådanne spørgsmål. Effekten af anti-integrin antistoffer på integrin-addressin interaktion er hidtil overvejende blevet evalueret af vurderingen bindende effekt/bindende hæmning med flowcytometri eller via statisk friktionskoefficient assays16,17 ,18,19,20, dermed med tilsyneladende forenkling og afvigelse fra den fysiologiske situation. Vi for nylig har etableret en dynamisk friktionskoefficient assay for at studere integrin-afhængige vedhæftning af menneskelige celler til addressins og virkningerne af anti-integrin antistoffer under shear stress2. Princippet om teknikken er tidligere blevet påvist med musen celler21,22. Her, det blev tilpasset og udviklet for at løse de ovennævnte translationel spørgsmål, åbning nye veje for bedre at forstå mekanismerne af behandling med anti-integrin antistoffer i vivo.
Den ovennævnte protokol beskriver en nyttig teknik til at studere dynamisk vedhæftning af menneskelige immunceller til endotel ligander. Gennem variation af de coatede ligander, perfunderet celletyper eller delgrupper, inkubation med yderligere stimuli eller forskellige neutraliserende antistoffer, det har næsten ubegrænset potentielle anvendelsesmuligheder. Sådanne dynamiske friktion assays kan derfor nyttigt at besvare begge grundlæggende spørgsmål af grundlæggende forskning samt translationel forespørgsler, …
The authors have nothing to disclose.
Forskning i KN, IA, MFN og SZ blev støttet af interdisciplinære Center for klinisk forskning (IZKF) og ELAN program af University Erlangen-Nürnberg, anden Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, tysk Crohns og Colitis Foundation (DCCV), den kliniske forskning gruppe CEDER af tysk forskning Rådet (DFG), programmet DFG emne på mikrobiota, det nye felt initiativ og den DFG Collaborative Research Centre 643, 796 og 1181.
48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
CaCl2 | Merck | 2382 | |
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
HEPES | VWR | J848-100ML | |
Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MgCl2 | Roth | ||
MnCl2 | Roth | ||
mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
NaCl | Roth | 3957.3 | |
Natalizumab | Biogen | ||
Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |