Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Summary

Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.

Abstract

Plusieurs pathologies de le œil sur la fonctionnalité et/ou la survie de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE). Il s’agit de certaines formes de rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La thérapie cellulaire est l’un des plus prometteurs stratégies thérapeutiques proposées pour soigner ces maladies, avec déjà encourageant les résultats préliminaires chez l’humain. Toutefois, la méthode de préparation de la prothèse a une incidence importante sur ses résultats fonctionnels in vivo. En effet, les cellules RPE greffés comme une suspension cellulaire sont moins fonctionnels que les mêmes cellules transplantées comme un tissu rétinien. Ici, nous décrivons une méthode simple et reproductible pour ingénieur RPE tissu et sa préparation pour une implantation in vivo . Les cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines RPE sont ensemencées sur un support biologique, la membrane amniotique humain (jambon). Par rapport aux échafaudages artificiels, ce support a l’avantage d’avoir une membrane basale qui se trouve à proximité de la membrane de Bruch où des cellules RPE endogènes sont attachés. Cependant, sa manipulation n’est pas facile, et nous avons mis au point plusieurs stratégies pour sa mise en culture appropriée et préparation à la greffe in vivo.

Introduction

RPE est crucial pour la survie et l’homéostasie des photorécepteurs avec lequel il est étroitement associé à¹. Plusieurs conditions pathologiques modifient ses fonctionnalités et/ou de la survie, y compris les RP et AMD.

RP est un groupe de mutations de monogéniques héréditaires qui affectent les fonctions des photorécepteurs ou cellules RPE ou les deux^2,3. On estime que les mutations qui affectent spécifiquement le RPE cellules représentent 5 % de RP². La DMLA est une autre condition où la couche RPE est altérée, perte de la vision en fin de compte à central principal. AMD est causée par les interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux et affecte les personnes âgées^4,5,6. Selon les projections, AMD sera un sujet de préoccupation pour les patients 196 millions dans le monde en 2020,⁷. Pour ces troubles, aucun remède efficace n’existe, et l’une des stratégies proposées est la transplantation des nouvelles cellules RPE afin de compenser les morts/non-fonctionnel préexistante RPE cellules⁸.

Le mode de formulation du produit final doivent être greffés est essentiel pour assurer les meilleurs résultats fonctionnels. Les cellules RPE injectés sous forme de suspension cellulaire, en dépit d’être une méthode simple et directe de la livraison, soulèvent des préoccupations au sujet de leur survie, l’intégration et la fonctionnalité^{9,10,11,12 , 13}. les scientifiques développent plus des formules complexes pour livrer engineered tissu rétinien^{9,13,14,15,16}. Dans ce contexte, nous avons développé une méthode originale pour produire in vitro RPE des tissus qui pourraient être utilisés pour transplantation⁹.

Les banques de cellules RPE dérivés de cellules souches embryonnaires humaines (ES) sont utilisés dans le présent protocole. Cependant, alternative RPE de cellules provenant de sources différentes cellules (cellules souches pluripotentes induites par l’homme, les cellules primaires de RPE, etc.), les banques et différenciées avec une méthode différente sont également appropriés pour ce protocole. Il comprend la différenciation dirigée de protocoles à l’aide de cytokines et/ou petites molécules^{17,18,19,20,21,22}.

Pour être transplantés, l’ingénierie tissulaire doit être préparé sur un échafaud. En quelques années, les échafaudages différents reposent sur un polymère ou sur une matrice d’origine biologique^13,23,24. Ici, le substrat biologique utilisé est le jambon, mais les autres substrats, comme les membranes dénudées de Bruch, pourraient être mises en œuvre. La méthode décrite ici a l’avantage d’utiliser un échafaudage biologique qui concerne davantage l’environnement natif de RPE.

ES cellules dérivées RPE des cellules humaines sont cultivées pendant au moins 4 semaines afin d’être entièrement organisé comme une monocouche de pavés. À ce stade, l’épithélium obtenu est fonctionnel et polarisé⁹. Enfin, comme ce tissu rides facilement, il est enchâssé dans une fine couche d’un transporteur d’hydrogel pour lui donner plus de rigidité et d’élasticité et de le protéger pendant la procédure d’injection. Ce produit est ensuite stocké à 4 ° C jusqu’au greffage.

Protocol

Tous les matériaux humains utilisés dans le présent protocole ont été utilisés conformément à la réglementation de l’Union européenne. La lignée de cellules ES humaine utilisée dans cette étude a été dérivée d’un embryon unique. Le couple qui avait fait don de l’embryon a été pleinement informé et ont donné leur consentement pour un don anonyme. Une lignée de cellules ES humaine cliniques de qualité a été dérivée de cet embryon, s’est inclinée, qualifiée et correctement documentée pa…

Representative Results

Jambons contiennent une couche épithéliale qui doit être retirée avant l’ensemencement des cellules RPE. Un traitement enzymatique de la membrane est exécuté avec la thermolysine sous agitation. Afin de ne pas perdre la polarité de la membrane (l’épithélium est d’un seul côté), il est fixé sur un support dont la composition pourrait être différente selon le fournisseur (Figure 1 a). Vérifier l’adhérence de la membrane pour son soutien …

Discussion

Nous avons décrit une méthode pour la culture des cellules RPE sur un échafaudage biologique et sa préparation pour l’implantation dans des modèles animaux. Une des étapes critiques du protocole est le maintien de l’orientation du jambon tout au long de la procédure jusqu’à ce que son inclusion dans la gélatine. En effet, l’épithélium native de la membrane est enlevé et sa membrane basale devient exposé⁹. Les cellules RPE doivent être semées sur le dessus de cette membrane bas…

Materials

Sterile biosafety cabinet	TechGen International	Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration	Vacuubrand	BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200 µL pipette: P200	Gilson	F144565
1 mL pipette: P1000	Gilson	F144566
Pipet aid	Drummond	75001
+4 °C refrigerator	Liebherr	Not applicable
Vibratome	Leica	VT1000S
Fine scissors	WPI	501758
Forceps (x2)	WPI	555227F
Water bath	Grant subaqua pro	SUB6
Precision balance	Sartorius	CP225D
Centrifuge	Eppendorff	5804
Microscope	Olympus	SC30
Horizontal Rocking Shaker	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Disposable Scalpel	WPI	500351
plastic paraffin film	VWR	PM992
0.200 µm single use syringe filter	SARTORIUS	16532
Syringe without needle 50 mL	Dutscher	50012
Bottles 250mL	Dutscher	28024
15 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352097
50 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352098
culture insert	Scaffdex	C00001N
60 mm cell culture disches: B6	Dutscher	353004
12 well cell culture plate	Corning	3512
6-well culture plates	Corning	3506
Razor blades	Ted Pella, Inc	121-9
Cyanoacrylate glue	Castorama	3178040670105
PBS 1X (500 mL)	Sigma	D8537
Thermolysine	Roche	5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100X)	Invitrogen	11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM)	Invitrogen	31350-010
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122
CO2-independent medium	GIBCO	18045-054
Gelatin	MERCK	104078
human amniotic membrane	Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)	Not applicable