Den P19 mus embryonal carcinoma cellinjer (P19 cellinjer) används ofta för att studera den molekylära mekanismen för neurogenes med stor förenkling jämfört med in vivo analys. Här presenterar vi ett protokoll för retinoinsyra syra-inducerad neurogenes i P19 cell linjen.
Den P19 cellinjer härrör från en mus embryo-derived teratocarcinom har förmågan att differentiera till de tre bakterie lagren. I närvaro av retinoinsyra syra (RA), den suspension odlade P19 cellinjer induceras för att differentiera till nervceller. Detta fenomen utreds utförligt som en neurogenes modell in vitro. Därför, den P19 cellinjer är mycket användbart för molekylära och cellulära studier i samband med neurogenes. Emellertid, protokoll för neuronala differentiering av P19 cellinjer som beskrivs i litteraturen är mycket komplexa. Den metod som utvecklats i denna studie är enkel och kommer att spela en roll i att belysa de molekylära mekanismerna i neurologiska utvecklingsstörningar och neurodegenerativa sjukdomar.
Under embryonal utveckling, ett enda cellskikt omvandlas till tre separata bakterie skikt1,2,3. För att öka forskningsmöjligheterna för fenomen som inträffar in vivo har generering av tredimensionella aggregat (embryonala kroppar) utvecklats som en praktisk modell. Cellulära aggregat bildas på detta sätt kan utsättas för olika förhållanden som orsakar celldifferentiering, som återspeglar utvecklingen av embryot4,5. Den P19 murina embryonal carcinoma cell linje (P19 cellinjer) används ofta som en cellulär modell för neurogenes studier in vitro-6,7,8. Den P19 cellinjer uppvisar typiska pluripotenta stamceller funktioner och kan differentiera till nervceller i närvaro av retinoinsyra (RA) under cell aggregering följt av neurit utväxt under anhängare villkor. Dessutom, den odifferentierade P19 cell linjen är också kapabel att bilda muskel-och kardiomyocyte-liknande celler under påverkan av dimetylsulfoxid (DMSO)9,10,11,12.
Många metoder13,14,15,16 har rapporterats för neuronala differentiering, men metoden är ibland komplicerat och inte lätt att förstå genom att bara läsa beskrivningarna. Till exempel, protokoll kräver ibland en kombination av Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) medium kompletteras med en blandning av kalv serum (CS) och foster bovint serum (FBS)13. Dessutom, medier som används för neuronala utveckling består ofta av neurobasal och B27 kosttillskott13,14,15,16. Som sådan, befintliga metoder innehåller komplexitet i deras beredning och vårt mål här är att förenkla protokollen. I denna studie, vi visade att DMEM med FBS kan utnyttjas för att upprätthålla P19 cellinjer (DMEM + 10% FBS) samt för neuronala utveckling (DMEM + 5% FBS + RA). Denna förenklade metod för neurogenes med hjälp av P19 cellinjer ger oss möjlighet att studera den molekylära mekanismen för hur neuroner utvecklas. Dessutom bedrivs även forskning om neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom med hjälp av P19 cell linje17,18, och vi anser att den metod som utvecklats i denna studie kommer att spela en roll i att belysa molekylära mekanismer i neurologiska utvecklingsstörningar och neurodegenerativa sjukdomar.
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för neurogenes med hjälp av P19-celllinjen. Även om många rapporter har publicerats i detta avseende, en detaljerad metod för neurogenes induktion med P19 cellinjer är fortfarande oklart. Dessutom utnyttjade vi en enkel hög glukos (4 500 mg/L) DMEM medium med 10% FBS för hela experimentet. Detta tillät oss att utföra det neurogena experimentet på ett användarvänligt sätt och utöka användningen av denna metod för framtiden.
De mest kritisk…
The authors have nothing to disclose.
Studien stöddes ekonomiskt av National Science Centre, Polen (Grant No. UMO-2017/25/N/NZ3 nätters/01886) och KNOW (ledande nationellt forskningscentrum) vetenskapligt konsortium “hälsosamma djur säkra livsmedel”, beslut av ministeriet för vetenskap och högre utbildning nr. 05-1/KNOW2/2015
6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
Cell Culture Plastics | |||
1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |