Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow
Summary
Mechanosensitive ionenkanalen worden vaak bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met patch-clamp opname. Afhankelijk van het experimentele protocol, kan de uitkomst op vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen echter onjuist. Hier, bieden wij methoden voor het voorkomen en corrigeren van dergelijke fouten met een theoretische basis.
Abstract
Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-stimulans waarmee veel fysiologische en pathologische processen, zoals vloeibare stroom-geïnduceerde vasodilatatie. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistof stroom/schuifspanning kracht niet volledig begrepen worden, kan kritisch fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating bijdragen. Daarom, fluid flow/schuifspanning kracht gevoeligheid van ionenkanalen is onderzocht met behulp van de patch-clamp techniek. Afhankelijk van het experimentele protocol, kunnen de resultaten en de interpretatie van gegevens echter onjuist. Hier presenteren we experimentele en theoretische bewijzen voor fluid flow-gerelateerde fouten en voorzien in methoden voor het schatten, preventie en het corrigeren van deze fouten. Veranderingen in junction potentiële tussen de Ag/AgCl-elektrode en Baden vloeistof werden gemeten met een open pipet gevuld met 3 M KCl vloeistofstromen kan dan verschuiven de vloeistof/metaal junction potentiële tot ongeveer 7 mV. Omgekeerd, door het meten van de verschuiving van de spanning geïnduceerd door vloeistofstromen, geschat we de ion-concentratie in de ongemengde grenslaag. In de rusttoestand, kunnen de echte ion concentraties grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode of ion kanaal inlaat aan het celmembraan oppervlak bereiken zo laag als ongeveer 30% van die in de voorwaarde van de stroom. Plaatsen van een agarose 3 M kan KCl brug tussen de zwemwater-vloeistof en referentie-elektrode hebben verhinderd indien dit probleem van het verschuiven van potentiële junction. De ongemengde laageffect grenzend aan het oppervlak van de celmembraan kan echter niet worden vastgesteld op deze manier. Hier bieden we een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag met een pipet open patch-clamp, wijzend op het belang van het gebruik van een agarose zout-brug terwijl het bestuderen van de vloeistof stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. Dus, deze nieuwe aanpak, waarin rekening wordt gehouden met de reële concentraties van ionen in de ongemengde grenslaag, nuttig inzicht kan verschaffen over de proefopzet en interpretatie van de gegevens aan vloeistof schuifspanning verordening van ionenkanalen gerelateerde .
Introduction
Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-cue waarmee veel fysiologische en pathologische processen zoals fluid flow-geïnduceerde vasodilatatie en vloeistof schuintrekken kracht-afhankelijke vasculaire remodeling en ontwikkeling1,2, 3,4,5. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistofstromen schuintrekken kracht niet helemaal begrepen zijn, gaat men ervan uit dat de fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating kritisch tot de vloeistof stroom-geïnduceerde reacties5 bijdragen kan , 6 , 7 , 8. bijvoorbeeld de activering van het endotheel innerlijke gelijkrichter Kir2.1 en Ca2 +-geactiveerde K+ (KCa2.3, KCNN3) kanalen na Ca2 + toestroom door vloeistofstromen heeft gesuggereerd om bij te dragen tot vloeistof stroom-geïnduceerde vasodilatatie6,7,8. Daarom veel ionenkanalen, vooral mechanisch-geactiveerde of -geremde kanalen, zijn bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met de patch-clamp techniek6,9,10 , 11. afhankelijk van het experimentele protocol taakuit patch-clamp opnemen, uitkomsten en interpretatie van de gegevens op de vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen kunnen echter foutieve10,11.
Een bron van vloeibare stroom-geïnduceerde artefacten in patch-clamp opname is vanaf de samenvloeiing potentiële tussen de Badvloeistof en Ag/AgCl referentie elektrode11. Het is algemeen aangenomen dat de vloeistof/metaal-kruising potentieel tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode constant, is zoals de Cl– -concentratie van de vloeistof zwemmen blijft constant, gelet op de chemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode te zijn:
AG + Cl–↔ AgCl + elektron (e–) (vergelijking 1)
Echter, in een geval waar de totale elektrochemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode (vergelijking 1) opbrengst van links naar rechts, de concentratie van de Cl– van de Baden vloeistof grenzend aan de Ag/AgCl verwijzing elektrode (ongemengde grenslaag12,13,14,15) wellicht veel lager dan die in de bulk van het zwemwater oplossing, tenzij genoeg convectional transport te waarborgen. Het gebruik van een oude of niet-ideale Ag/AgCl-elektrode met inadequate chlorering van Ag kan dergelijk risico verhogen. Deze vloeistof stroom-gerelateerde artefact op de referentie-elektrode, in feite, kan worden uitgesloten door het simpelweg plaatsen van een conventionele agarose-zout-brug tussen de Baden vloeistof en referentie-elektrode, aangezien het artefact is gebaseerd op wijzigingen in de reële Cl– concentratie grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode11. Het protocol gepresenteerd in deze studie beschrijft hoe te voorkomen van de mogelijke wijzigingen van de stroom-gerelateerde junction en meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag.
Na het plaatsen van een agarose KCl brug tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode, is er een andere cruciale factor die u moet overwegen: net zoals de verwijzing Ag/AgCl-elektrode fungeert als een Cl– -elektrode, de ionenkanalen ook kunnen functioneren zoals een ion-selectieve elektrode. De situatie van een ongemengde grenslaag tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode ontstaat tijdens de beweging van ionen tussen de extracellulaire en intracellulaire oplossingen via het membraan ionenkanalen. Dit impliceert dat voorzichtigheid moet worden gebruikt wanneer de interpretatie van het Reglement van ion kanalen door vloeistofstromen. Zoals besproken in onze eerdere studie11, de beweging van ionen via een oplossing waarin een elektrochemische gradiënt aanwezig is via drie verschillende mechanismen kan optreden: diffusie, migratie en convectie, waar diffusie de beweging is geïnduceerd door verloop van de concentratie, migratie is de beweging gedreven door elektrische verloop en convectie is het verkeer door middel van vloeistof-flow. Onder deze drie vervoer mechanismen, draagt convectie modus bij de meeste aan de beweging van ionen11 (> 1.000 keer groter is dan de verspreiding of migratie onder gebruikelijke patch-clamp-instellingen). Dit vormt de theoretische basis van waarom junction potentiële tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode kan zeer onder verschillende voorwaarden voor statische en vloeistof-flow11.
Volgens de hypothese voorgesteld hierboven, sommige facilitatory effecten van vloeistofstromen op de huidige ionkanaal kunnen worden afgeleid uit de convectie restauratie van echte ion concentraties grenzend aan de inlaat van kanaal aan de oppervlakte van het membraan (ongemengde grenslaag) 10. In dit geval de vloeistof stroom-geïnduceerde effecten op ion kanaal stromingen zijn eenvoudigweg ontstaan uit elektrochemische gebeurtenissen, niet van het Reglement van ion kanaal gating. Een soortgelijk idee was eerder voorgesteld door Barry en collega’s12,13,14,15 op basis van strenge theoretische overwegingen en experimenteel bewijs, ook bekend als de ongemengde laag of vervoer nummer effect. Als sommige ionenkanalen voldoende voordoen enkellijns geleidingsvermogen en lang genoeg open-tijd om te zorgen voor voldoende vervoer tarieven via de kanalen (vervoer sneller in het membraan dan in het ongemengde membraan oppervlak), een grenslaag effect . Dus, de convectie-afhankelijke vervoer kan bijdragen tot de uiteindelijke vloeistof-stroom-geïnduceerde faciliteiten van ion huidige10,12,13,14,15.
In deze studie, benadrukken wij het belang van het gebruik van een agar of agarose zout-brug terwijl het bestuderen van vloeistof-stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. We bieden ook een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode en membraan ionenkanalen. Bovendien, de theoretische interpretatie van vloeistof stroom-geïnduceerde modulatie van ion kanaal stromen (dat wil zeggen, convectie hypothese of ongemengde vervoer nummer laageffect) kunnen waardevolle inzichten voor het ontwerpen en het interpreteren van onderzoeken op de shear kracht-regulatie van ionenkanalen. Volgens het ongemengde grenslaag vervoer nummer effect voorspellen we dat ion kanaal stromen via alle soorten membraan ionenkanalen kunnen worden vergemakkelijkt door vloeistofstromen, onafhankelijk van hun biologische gevoeligheid voor vloeistofstromen schuintrekken kracht, maar alleen als de ionenkanalen hebben voldoende enkellijns geleidingsvermogen en open-lang. Hogere ion kanaal huidige dichtheden kan verhogen de ongemengde grenslaag effect op het oppervlak van de celmembraan.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit onderzoek aangetoond we een methode voor het meten van echte Cl– -concentratie in de ongemengde laag grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode door bepaling van de potentiële vloeistof-metaal-kruising met een open patch-clamp pipet gevuld met een hoge KCl concentratie. De veranderingen in de concentratie van de Cl– in de grenslaag kan resulteren in een verschuiving van kruising potentieel Wanneer overschakelen van statisch naar vloeistof-stromingscondities. Eenvoudig met behulp van een agarose KCl b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de Pioneer Research Center Program (2011-0027921), door fundamentele wetenschap onderzoeksprogramma’s (2015R1C1A1A02036887 en NRF-2016R1A2B4014795) door de National Research Foundation Korea gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & Toekomst Planning, en door een subsidie van de Korea Health Technology R & D Project via de Korea gezondheid industrie Development Institute (KHIDI), gefinancierd door het ministerie van gezondheid & welzijn, Republiek Korea (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- . A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018)
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
