ह्वेल ऊतकों में information and अर्द्ध-मात्रा चांदी के Autometallography का प्रयोग
Summary
एक प्रोटोकॉल autometallography द्वारा ह्वेल जिगर और गुर्दे के ऊतकों में एजी स्थानीयकृत करने के लिए प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, एक नई परख, ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) नाम के लिए उन ऊतकों में एजी सांद्रता अनुमान विकसित की है ।
Abstract
सिल्वर नैनोकणों (AgNPs) अपने मजबूत रोगाणुरोधी प्रभाव के कारण, वस्त्र, सौंदर्य प्रसाधन, और स्वास्थ्य देखभाल मदों सहित वाणिज्यिक उत्पादों में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है । वे भी वातावरण में जारी किया जा सकता है और समुद्र में संचित । इसलिए, AgNPs एजी संदूषण के प्रमुख स्रोत हैं, और एजी के पर्यावरण विषाक्तता के सार्वजनिक जागरूकता बढ़ रही है । पिछले अध्ययनों से (उत्पादकों में) और इज़ाफ़ा (उपभोक्ताओं में) () एजी के (शिकारियों) में वृद्धि का प्रदर्शन किया है । केटासियन, महासागर के शीर्ष शिकारियों के रूप में, नकारात्मक एजी द्वारा प्रभावित हो सकता है/ हालांकि ह्वेल ऊतकों में ag/ag यौगिकों की सांद्रता inductively युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-ms) द्वारा मापा जा सकता है, आईसीपी-ms का उपयोग अपनी उच्च पूंजीगत लागत और ऊतक भंडारण के लिए आवश्यकता के द्वारा सीमित है/ इसलिए, formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक का उपयोग करके एक छवि मात्रात्मक विश्लेषण के साथ एक autometallography (AMG) विधि एक सहायक विधि को उपअंग स्तर पर एजी वितरण स्थानीयकरण और ह्वेल में एजी एकाग्रता का अनुमान हो सकता है ऊतकों. AMG सकारात्मक संकेत मुख्य रूप से समीपस्थ गुर्दे ट्यूबलर उपकला, हेपैटोसाइट्स, और Kupffer कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में विभिन्न आकारों के काले granules के लिए भूरे रंग के हैं । कभी-कभार, कुछ अमली सुनहरा पीला करने के लिए ब्राउन AMG सकारात्मक संकेतों में कुछ समीपस्थ गुर्दे नलिकाओं के लुमेन और तहखाने झिल्ली में उल्लेख कर रहे हैं । एजी एकाग्रता का आकलन करने के लिए परख ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) है, जो एक प्रतिगमन मॉडल AMG विधि और आईसीपी की छवि मात्रात्मक विश्लेषण से डेटा द्वारा स्थापित-MS है नाम है । CHAA के साथ AMG का उपयोग करने के लिए स्थानीयकरण और अर्द्ध मात्रा भारी धातुओं spatio-लौकिक और पार प्रजातियों के अध्ययन के लिए एक सुविधाजनक पद्धति प्रदान करता है ।
Introduction
सिल्वर नैनोकणों (AgNPs) व्यापक रूप से वस्त्र, सौंदर्य प्रसाधन, और स्वास्थ्य देखभाल आइटम, उनके महान रोगाणुरोधी प्रभाव1,2के कारण सहित वाणिज्यिक उत्पादों में इस्तेमाल किया गया है । इसलिए, AgNPs के उत्पादन और AgNP-युक्त उत्पादों की संख्या में वृद्धि हुई है समय3,4। हालांकि, AgNPs वातावरण में जारी किया जा सकता है और समुद्र में जमा5,6। वे एजी संदूषण के प्रमुख स्रोत बन गए हैं, और एजी के पर्यावरण विषाक्तता के सार्वजनिक जागरूकता बढ़ रही है ।
समुद्री वातावरण में AgNPs और एजी की स्थिति जटिल और लगातार बदलती जा रही है. पिछले अध्ययनों से संकेत दिया है कि AgNPs कणों के रूप में रह सकते हैं, कुल, भंग, विभिन्न रासायनिक प्रजातियों के साथ प्रतिक्रिया, या एजी से पुनर्जीवित किया जा+ आयनों7,8. AgCl के रूप में एजी यौगिकों के कई प्रकार, समुद्री तलछट में पाया गया है, जहां वे benthic जीवों द्वारा घूस लिया जा सकता है और खाद्य श्रृंखला9,10दर्ज करें । एक पिछले ताइवान के पश्चिमी तट के साथ ची-कू लैगून क्षेत्र में किए गए अध्ययन के अनुसार, समुद्री तलछट के एजी सांद्रता बहुत कम है और पपड़ी बहुतायत के समान हैं, और मछली जिगर ऊतक के उन आम तौर पर पता लगाने के नीचे है सीमा (< ०.०२५ μg/g गीले/11. हालांकि, पिछले विभिंन देशों में किए गए अध्ययन केटासियन12,13के जिगर में अपेक्षाकृत उच्च एजी सांद्रता का प्रदर्शन किया है । केटासियन के जिगर में एजी एकाग्रता उंर पर निर्भर है, सुझाव है कि उनके शरीर में एजी के स्रोत सबसे अधिक संभावना है उनके शिकार12। इन निष्कर्षों को आगे उच्च पौष्टिकता स्तर पर पशुओं में एजी की वृद्धि का सुझाव देते हैं । केटासियन, महासागर में शीर्ष शिकारियों के रूप में, नकारात्मक स्वास्थ्य एजी/एजी यौगिकों12,13,14के कारण प्रभावों का सामना करना पड़ सकता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, केटासियन की तरह, मानव स्तनधारी हैं, और नकारात्मक स्वास्थ्य केटासियन में एजी/एजी यौगिकों के कारण प्रभावों को भी मनुष्य में हो सकता है । दूसरे शब्दों में, केटासियन समुद्री पर्यावरण और मनुष्यों के स्वास्थ्य के लिए प्रहरी पशु हो सकता है । इसलिए, स्वास्थ्य प्रभाव, ऊतक वितरण, और केटासियन में एजी की एकाग्रता बड़ी चिंता का विषय हैं ।
हालांकि ह्वेल ऊतकों में ag/ag यौगिकों की सांद्रता inductively युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-ms) द्वारा मापा जा सकता है, आईसीपी-ms का उपयोग अपनी उच्च पूंजीगत लागत (साधन और रखरखाव) और ऊतक भंडारण के लिए आवश्यकताओं द्वारा सीमित है /preparation१२,१५. इसके अलावा, यह आमतौर पर सैंय कठिनाइयों, जनशक्ति की कमी के कारण असहाय ह्वेल मामलों की सभी जांच में व्यापक ऊतक नमूने इकट्ठा करने के लिए मुश्किल है, और संबंधित संसाधनों की कमी12। आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए जमे हुए ऊतक के नमूने आसानी से सीमित प्रशीतन अंतरिक्ष के कारण संग्रहीत नहीं कर रहे हैं, और जमे हुए ऊतक के नमूनों टूटे प्रशीतन उपकरण12के कारण छोड़ दिया जा सकता है । इन aforementioned बाधाओं आईसीपी द्वारा ह्वेल ऊतकों में संक्रमण के स्तर की जांच में बाधा-एमएस जमे हुए ऊतक नमूनों का उपयोग कर विश्लेषण । इसके विपरीत, formalin निश्चित ऊतक नमूने मृत-असहाय केटासियन के necropsy के दौरान इकट्ठा करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं । इसलिए, यह एक आसान उपयोग करने के लिए और सस्ती विधि का पता लगाने के लिए विकसित करने के लिए आवश्यक है ह्वेल ऊतकों में भारी धातुओं formalin निश्चित ऊतक के नमूनों का उपयोग करके/
हालांकि उपअंग वितरण और क्षार और क्षारीय पृथ्वी धातुओं की सांद्रता formalin के दौरान बदला जा सकता है-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) प्रक्रिया, केवल इस तरह के एजी के रूप में संक्रमण धातुओं पर कम प्रभाव,16उल्लेख किया गया है । इसलिए, FFPE ऊतक धातु स्थानीयकरण और माप के लिए एक आदर्श नमूना संसाधन के रूप में माना गया है16,17. Autometallography (AMG), एक histochemical प्रक्रिया, भारी धातुओं को बढ़ाना कर सकते है के रूप में कम से कम सुनहरा पीला काले FFPE ऊतक वर्गों पर सकारात्मक संकेतों AMG आकार, और इन परिवर्धित भारी धातुओं प्रकाश माइक्रोस्कोपी18के तहत visualized किया जा सकता है, 19 , 20 , 21. इसलिए, AMG विधि भारी धातुओं के उपअंग वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है । यह जैविक प्रणालियों में भारी धातुओं के चयापचय रास्ते का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं क्योंकि आईसीपी-MS केवल अंग स्तर18पर भारी धातुओं की एकाग्रता उपाय कर सकते हैं । इसके अलावा, डिजिटल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, ImageJ के रूप में, ऊतकवैज्ञानिक ऊतक वर्गों के मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है22,23. FFPE ऊतक वर्गों के सकारात्मक संकेतों को quantified और भारी धातुओं की सांद्रता का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि निरपेक्ष एजी एकाग्रता छवि मात्रात्मक विश्लेषण के साथ AMG विधि द्वारा सीधे निर्धारित नहीं किया जा सकता है, यह छवि मात्रात्मक विश्लेषण और आईसीपी-MS, जो नाम है ह्वेल से प्राप्त आंकड़ों के आधार पर एक प्रतिगमन मॉडल द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है ऊतकवैज्ञानिक एजी (CHAA) परख । सबसे असहाय केटासियन में आईसीपी-एमएस विश्लेषण द्वारा एजी सांद्रता मापने में कठिनाइयों को ध्यान में रखते हुए, CHAA एक मूल्यवान सहायक विधि ह्वेल ऊतकों में एजी सांद्रता का अनुमान है, जो आईसीपी द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है-ms जमे हुए की कमी के कारण विश्लेषण ऊतक के नमूने । इस पत्र में एक histochemical तकनीक के प्रोटोकॉल का वर्णन (AMG विधि) उपअंग स्तर पर एजी स्थानीयकरण के लिए और एक CHAA का नाम परख जिगर और केटासियन की गुर्दे के ऊतकों में एजी सांद्रता का अनुमान है ।
चित्रा 1: ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख (CHAA) की स्थापना और आवेदन का चित्रण फ़्लोचार्ट एजी सांद्रता का आकलन करने के लिए । CHAA = ह्वेल ऊतकवैज्ञानिक एजी परख, FFPE = Formalin-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड, आईसीपी-MS = inductively प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी युग्मित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
लेख के अध्ययन के प्रयोजन के लिए एक सहायक विधि को उपअंग के स्तर पर एजी वितरण का मूल्यांकन करने के लिए और ह्वेल ऊतकों में एजी सांद्रता अनुमान स्थापित है । वर्तमान प्रोटोकॉल शामिल है 1) आईसीपी द्वारा ह्वेल ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ताइवान ह्वेल सोसायटी, ताइपे सहित नमूना संग्रह और भंडारण के लिए ताइवान ह्वेल किनारा नेटवर्क का धन्यवाद; ह्वेल अनुसंधान प्रयोगशाला (प्रो धारणाधिकार-सियांग चाऊ), पारिस्थितिकी और विकासवादी जीवविज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय ताइवान विश्वविद्यालय, ताइपे; राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान संग्रहालय (Dr. Chiou-जू याओ), ताइचुंग; और समुद्री जीव विज्ञान और ह्वेल अनुसंधान केंद्र, राष्ट्रीय चेंग-कुंग विश्वविद्यालय । हम भी वानिकी ब्यूरो, कृषि परिषद, उनके परमिट के लिए कार्यकारी युआन धंयवाद ।
Materials
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | — | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
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