В режиме реального времени в Vivo отслеживания тимоцитов в передней камере глаза лазерная сканирующая микроскопия
Summary
Целью протокола является показать продольной прижизненной слежение в реальном времени тимоцитов, лазерной сканирующей микроскопии в тимуса имплантатов в передней камере глаза мыши. Прозрачность роговицы и васкуляризация трансплантат позволяет непрерывно записывать прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выхода.
Abstract
Представлен метод призвана показать, в первый раз, пересадка новорожденных thymi в передней глаз палаты isogenic взрослых мышей в vivo продольной реального времени мониторинга динамики thymocytes´ в пределах васкуляризированной Тимус сегмент. После трансплантации лазерной сканирующей микроскопии (МИС) через роговицу позволяет в vivo неинвазивной повторяющихся изображений на уровне клеточных резолюции. Важно отметить, что подход добавляет предыдущих прижизненной созревание Т-клеток, визуализации модели возможность непрерывного прогениторных клеток вербовки и зрелых Т-клеток выход записи в то же самое животное. Дополнительные преимущества системы являются прозрачность привитые области, позволяющие макроскопических быстрого мониторинга имплантированных ткани, и доступность для имплантации, позволяя для локализованных в дополнение к системной терапии. Основным ограничением является объем ткани, вписывается в ограниченном пространстве глаз камеры, которая требует для обрезки лепестка. Целостности органа максимизируется путем рассечения тимуса лопастями в шаблоны, ранее показанный функциональным для зрелых Т-клеток производства. Техника потенциально подходит допросить окружение медицински соответствующих вопросов, связанных с тимуса функции, которые включают аутоиммунные заболевания, приобретенного иммунодефицита и центральной толерантности; процессы, которые остаются механистически плохо определены. Тонкой рассечение руководящих тимоцитов миграции, дифференциация и выбор механизмов должно привести к Роман терапевтические стратегии ориентации развивающихся Т-клеток.
Introduction
Intrathymic Т-клеточная дифференцировка и выбор субпопуляции Т-клеток являются ключевых процессов для развития и поддержания клеточного иммунитета в позвоночных1. Этот процесс включает в себя сложные последовательности плотно организованных мероприятий, включая вербовку прародителей от крови, пролиферации и миграции, дифференциальной выражение мембранных белков, и массивные запрограммированная смерть клетки для подмножества выбор. Результатом является освобождение зрелых Т-клетки реагируют на большой спектр иностранных антигены во время отображения свернутого ответы на self пептиды, которые конца вверх колонизировать периферических лимфоидных органов отдельных2,3. Аберрантное тимоцитов выбор репертуара αβTCR приводит к аутоиммунным заболеванием или иммунных дисбаланс4 , которые главным образом являются производными от дефектов во время процесса отбора положительное или отрицательное прекурсоров, соответственно.
Направления миграции тимоцитов через тимуса является неотъемлемой частью всех стадий созревания Т-клеток и это предусмотрено как серию одновременное или последовательное несколько стимулов, включая chemokines, клей, и снять клей внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия протеина3,5. Изучение фиксированных тканей оказывает крайне необходимую информацию о характере выражения для мигрирующих подсказки тимоцитов в определенных тимуса микросреды5,6, в то время как ex vivo исследований выявил два распространенных мигрирующие поведение тимоцитов в два гистологически различных областях органа: медленный Стохастический движений в коре и быстрый, ограничивается подвижность в продолговатого мозга-7,–8,9,10 , 11 , 12 , 13. увеличение миграционных ставки коррелируют с тимуса позитивного выбора13 и негативный выбор связан с поддерживая гипотезу, что кинетика путешествие через тимуса определяет правильное поведение при обходе созревания тимоцитов. Несмотря на их актуальности топология взаимодействия тимоцитов стромальных клеток и динамика тимоцитов моторики через орган микросреды во время созревания Т-клеток остаются плохо определены.
Большинство ex vivo исследования на сегодняшний день включают плода или reaggregate тимуса орган культур14,15, кусочки ткани или эксплантов нетронутыми доли тимуса, где тимоцитов движений визуализируются два фотона лазерного сканирования микроскопия (TPLSM)8, прижизненные изображения технику с ограниченным максимальное рабочее расстояние и визуализации глубиной 1 мм в соответствии с ткани изучены16. В отличие от кропотливого тимуса орган культур, которые зависят от расширенной инкубации раз в виде 3D-структуры, предварительно помечены как, тимуса ломтик технику, так и нетронутыми доли тимуса подход разрешение контроль введения определенных подмножеств тимоцитов в среду архитектуры родной ткани. Однако, так как поток крови отсутствует в этих моделях, они явно ограничены для изучения процесса набора персонала, урегулирования прародителями (ОТУ) тимуса паренхиме или динамика тимуса egression зрелых Т-лимфоцитов тимуса.
В естественных условиях модели для изучения тимуса Т-клеточной физиологии созревания в мышах включают графтов фрагментов или весь орган лопастями, размещены либо внутри почек капсула17 или intradermally18. Хотя эти варианты показал их полезности допросить системного функционального приживления ткани, позиция тимуса графтов глубоко внутри животного или охваченных слоев непрозрачной ткани ограничивает их использование для экспертизы в vivo имплантатов TPLSM.
Передней камеры глаза обеспечивает легкодоступными пространство для непосредственного мониторинга любых привитые ткани благодаря прозрачности роговицы слоя. Преимущество основание камеры, образованной радужки богат кровеносных сосудов и вегетативной нервных окончаний, позволяя быстрое реваскуляризации и Реиннервация графтов19,20. Д-р Caicedo успешно использовал это анатомические пространство для поддержания и продольной исследование панкреатических островков в прошлом21. Здесь мы показываем, что эта стратегия не только представляет собой допустимый подход к изучению тимоцитов динамика в структуре родной орган, но также однозначно разрешает продлить в vivo продольной записи к изучению прародитель вербовки и зрелых Т-клеточной egression шаги в мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ввиду важности процесса созревания Т-клеток для индивидуальной иммунной компетентности4 и предполагаемого воздействия прекурсоров клеток динамики на зрелых Т-клетки, производимые тимуса2,3инвестировали значительные усилия разработать ал?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грантов R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) и R21ES025673 (AC) и лучшие/2015/043 Грант (Consellería де Educació, cultura я киберспорта, Женералитата valenciana, Валенсия, Испания) (ЭО). Авторы благодарят команду отправлено в Universidad Católica де Валенсия Сан Висенте Мартир, Валенсия, Испания и Альберто Эрнандес в Centro de Investigación Принсипе Фелипе, Валенсия, Испания, за их помощь с видео съемки и редактирования.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
References
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?. Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
