Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale
Summary
L’obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell’alloggiamento anteriore dell’occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell’innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l’uscita di cellula T maturo.
Abstract
Lo scopo del metodo viene presentato è quello di mostrare, per la prima volta, il trapianto del neonato thymi nella camera anteriore dell’occhio di topi adulti isogeniche per in vivo longitudinale monitoraggio in tempo reale di thymocytes´ dinamiche all’interno di un vascolarizzato segmento di timo. Dopo il trapianto, microscopia (LSM) attraverso la cornea a scansione laser permette in vivo imaging ripetuti non invadente a livello cellulare ad alta risoluzione. D’importanza, l’approccio aggiunge alla maturazione delle cellule T videomicroscopia precedenti modelli di imaging la possibilità per il reclutamento di cellule progenitrici continuo e maturo della T-cellula egress registrazioni nello stesso animale. Ulteriori vantaggi del sistema sono la trasparenza dell’area innestata, permettendo il monitoraggio rapido macroscopica del tessuto impiantato, e l’accessibilità all’impianto consentendo localizzati oltre ai trattamenti sistemici. La limitazione principale essendo il volume del tessuto che si inserisce nello spazio ridotto della camera occhio che esige per il taglio del lobo. L’integrità dell’organo è massimizzata da lobi del timo in modelli precedentemente indicati per essere funzionale per la produzione di T-cellula matura di dissezione. La tecnica è potenzialmente adatta per interrogare un milieu di clinicamente rilevanti questioni relazionati alla funzione del timo che includono l’autoimmunità, immunodeficienza e tolleranza centrale; processi che rimangono meccanicistico scarsamente definiti. La raffinata dissezione dei meccanismi guida timociti migrazione, differenziazione e selezione dovrebbe portare a nuove strategie terapeutiche in via di sviluppo le cellule di T di targeting.
Introduction
Intratimica differenziazione a cellula T e selezione sottopopolazione di cellule T costituiscono processi chiave per lo sviluppo e la manutenzione di immunità cellulo-mediata in vertebrati1. Questo processo coinvolge una complessa sequenza di eventi strettamente organizzati, tra cui il reclutamento dei progenitori dal flusso sanguigno, la proliferazione e la migrazione, l’espressione differenziale di proteine di membrana e la morte cellulare programmata massiccia per sottoinsiemi selezione. Il risultato è il rilascio di cellule T mature reattive ad un ampio spettro di antigeni estranei durante la visualizzazione ridotta a icona risposte a self-peptidi, che finiscono colonizzare gli organi linfoidi periferici delle singole2,3. Selezione di timociti aberrante del repertorio αβTCR conduce alla malattia autoimmune o squilibrio immunitario4 che derivano principalmente da difetti durante i processi di selezione precursore positivo o negativo, rispettivamente.
Migrazione direzionale di timociti attraverso il timo è intrinseco a tutte le fasi di maturazione delle cellule T ed è concepito come una serie di simultanea o sequenziale stimoli multipli, tra cui chemochine, adesive, e de-adesivo della matrice extracellulare (ECM) proteina interazioni3,5. Lo studio dei tessuti fissi ha reso informazioni critiche per quanto riguarda i modelli di espressione per stecche migratori timociti in microambienti timica definiti5,6, mentre gli studi ex vivo ha rivelato due prevalente i comportamenti migratori dei timociti in due aree istologicamente distinte dell’organo: slow stochastic movimenti nella corteccia e motilità veloce, confinate nel midollo7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento tassi migratori correlano con selezione timica positiva13 e selezione negativa è associato con comportamento strisciante, supportando l’ipotesi che la cinetica del viaggio attraverso il timo determina il corretto maturazione dei timociti. Nonostante la loro rilevanza, la topologia delle interazioni delle cellule stromal timociti e le dinamiche della motilità di timociti attraverso microambienti organo durante la maturazione delle cellule T rimangono mal definite.
Maggior parte degli studi ex vivo eseguita fino ad oggi includono fetale o ricongiungessero organo timico culture14,15, fettine di tessuto o espianti di lobo timico intatto cui movimenti di timociti sono visualizzati da scansione laser del due-fotone microscopia (TPLSM)8, una tecnica di imaging videomicroscopia con un massimo limitato, distanza di lavoro e profondità di 1 mm in conformità con il tessuto di imaging ha esaminato16. In contrasto con le culture di organo timico laborioso che dipendono dai tempi di incubazione estesa a formare 3D-strutture, entrambi, la tecnica di fetta timica e l’introduzione di permesso controllata di approccio lobo timico intatto di sottoinsiemi particolari dei pre-etichettata timociti in ambienti dall’architettura tessuto nativo. Tuttavia, poiché il flusso sanguigno è assente in questi modelli, sono chiaramente limitati per lo studio del processo di reclutamento del timo sedimentazione dei progenitori (TSPs) al parenchima del timo o le dinamiche di egression timica dei linfociti T maturi.
Modelli in vivo per lo studio della fisiologia di maturazione delle cellule T timica in topi includono gli innesti di frammenti o lobi intero organo collocati sia all’interno della capsula renale17 o per via intradermica18. Anche se queste opzioni hanno mostrato la loro utilità per interrogare engraftment sistemico funzionale del tessuto, la posizione degli innesti timici profondi all’interno dell’animale o coperti da strati di tessuto opaco limita il loro uso per esame in vivo degli impianti di TPLSM.
La camera anteriore dell’occhio fornisce uno spazio facilmente accessibile per il monitoraggio diretto di qualsiasi tessuto innestato in virtù della trasparenza di strati corneali. Di vantaggio, la base della camera formata dall’iride è ricca di vasi sanguigni e terminazioni nervose autonomiche, consentendo la rapida rivascolarizzazione e reinnervazione del innesti19,20. Dr. Caicedo ha utilizzato con successo questo spazio anatomico per la manutenzione e lo studio longitudinale degli isolotti pancreatici nel passato21. Qui, indichiamo che questa strategia non solo costituisce un valido approccio per studiare la dinamica dei timociti all’interno della struttura nativa dell’organo, ma anche in modo univoco consente di estendere l’ in vivo longitudinale registrazioni allo studio del reclutamento di cellule progenitrici e passaggi di egression cellula T maturi nel topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dovuto l’importanza del processo di maturazione della T-cellula per competenza immunitaria individuale4 e il presunto impatto delle dinamiche delle cellule precursore su cellule T mature prodotte dal timo2,3, notevoli sforzi sono stati investiti sviluppare alternative all’approccio classico tessuto fisso dello snapshot.
Anche se fettine di tessuto e altri espianti sono chiaramente superiori a riprodurre l’archit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni NIH R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) e R21ES025673 (AC) e con la concessione BEST/2015/043 (Consellería de Educació, cultura ho esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spagna) (EO). Autori ringraziano la squadra di inviati presso la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spagna, Alberto Hernandez Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spagna per il loro aiuto con riprese video e montaggio.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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