Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

Summary

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Abstract

RNA interference - et génome édition axée sur les plateformes de dépistage ont été couramment pour identifier les facteurs de cellule hôte qui restreignent la réplication du virus. Toutefois, ces écrans sont généralement effectuées dans des cellules qui sont naturellement permissives au pathogène viral à l’étude. Par conséquent, la réplication robuste de virus dans des conditions de contrôle peut limiter la plage dynamique de ces écrans. En outre, ces écrans peuvent être incapables d’identifier facilement les voies de défense cellulaire qui restreignent la réplication du virus si le virus est bien adapté à l’hôte et capable de lutter contre les défenses antivirales. Dans cet article, nous décrivons un nouveau paradigme pour explorer les interactions virus-hôte grâce à l’utilisation des écrans qui se centre sur les infections naturellement avortées par arbovirus tels que les virus de la stomatite vésiculaire (VSV). Malgré la capacité de la VSV à reproduire dans un large éventail d’insectes diptères et hôtes mammifères, VSV subit une infection postérieure à la création avortée dans une variété de lignées cellulaires dérivées de lépidoptères, tels que la spongieuse (Lymantria dispar). Cependant, ces infections VSV avortées peuvent être « sauvées » lorsque les défenses antivirales des cellules hôte sont compromises. Nous décrivons comment VSV souches gènes codant de journaliste commode et restrictives dispar L. lignées cellulaires peuvent être couplées aux écrans de configuration afin d’identifier les facteurs de l’hôte impliqués dans restriction des arbovirus. En outre, nous montrons également l’utilité de ces outils de dépistage pour l’identification des facteurs virally codés que sauver la réplication VSV pendant la co-infection ou par le biais de l’expression ectopique, y compris celles encodées par des virus chez les mammifères. La limitation naturelle de la réplication dans les cellules de dispar L. VSV fournit un rapport signal sur bruit élevé lorsque le dépistage pour les conditions qui favorisent le sauvetage VSV, permettant ainsi l’utilisation d’épreuves simplistes luminescence et fluorescence dotés de surveiller les modifications dans la réplication de VSV. Ces méthodes sont utiles pour comprendre l’interaction entre réponses antivirales de l’hôte et des facteurs viraux évasion immunitaire.

Introduction

La capacité d’un virus de façon productive répliquer dans un hôte particulier est régie en partie par la disponibilité des facteurs de cellule hôte prenant en charge l’entrée virale et réplication¹. La gamme de virus-hôte peut aussi être dictée par la capacité d’un virus à compteur cellulaire antivirale défenses qui seraient autrement empêcher la réplication virale^2,3. Il est le fruit de ces interactions hôte-virus complexe qui décident en dernier ressort si un virus sera en mesure de terminer son cycle de vie dans un hôte particulier. Étant donné les conséquences potentiellement pathog....

Protocol

1. GENERALITES Lymantria dispar (LD652) Culture de cellules et Virus

1. LD652 cellule culture et placage
   1. À la culture dispar L.-dérivées des cellules LD652, maintenir une monocouche de cellules dans un milieu de culture (Table des matières) incubés à 27 ° C sous atmosphère normale. Maintenir les cellules en plats de tissu-culture-traitée de 10 cm et de passage des cellules en arrivant à confluence de 80 %.
   2. Plaque, déloger les cellules adhérentes de LD652 de la plaque en pipettant également les médias à plusieurs reprises sur la monocouche (ces cellules ne nécessitent pas de tryps....

Results

Par exemple des applications d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller le sauvetage VSV sur la co-infection VACV, LD652 cellules ont été plaqués dans un plat de lamelle de 8 puits puis infectés par le simulacre ou infectés par VSV-DsRed (MOI = 1) en présence ou en absence de VACV-FL-GFP (MOI = 25). Parce que VSV-DsRed exprime DsRed comme une protéine libre et n’est pas fusionné à protéines structurales de VSV (Figure 1 a), il est détecté uniquement aprè.......

Discussion

Ici, nous avons décrit simple base de fluorescence et de luminescence des tests pour dépister les conditions de sauvetage réplication VSV dans des cultures cellulaires de lépidoptères restrictives. L’infection avortée de la VSV dans les cellules lépidoptères crée un excellent rapport signal-bruit lors du dosage pour l’expression des gènes VSV. Par exemple, les signaux de LU détectés dans les lysats de simples infections VSV-LUC étaient ~ 1000 plus élevé que dans les lysats mock-infectés, mais ces signaux changé seulement.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaques de culture tissulaire 6 puits	CELLTREAT	229106
plaques de culture tissulaire 24 puits	CELLTREAT	229124
10 cm Boîtes de culture tissulaire	Corning	C430167
Grace' s Insect Medium	Sigma	G8142
EX-CELL 420	Sigma	14420C
Sérum fœtal bovin - Optima	Atlanta Biologicals	S12450
Milieu			de croissance 1:1 mélange de Grace’s Insect Medium et de milieu sans sérum EX-Cell 420 contenant également 1 % de solution d’antibiotique-antimycosique et 10 % de sérum de veau fœtal
Solution d’antibiotique-antimycosique (100&fois ;)	Sigma	A5955
Dulbecco' s Phosphate salin tamponné (DPBS)	Sigma	D8662
Milieu sans sérum (SFM)	Thermo Fisher	10902096
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Réactif de transfection	Thermo Fisher	10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25950CQC
Tampon de lyse rapporteur 5x	Promega	E3971
Réactif de dosage de la luciférase	Promega	E1483
Microplaques à 96 puits	Corning	3915
Anticorps anti-FLAG de souris	Wako	014-22383
Anticorps anti-luciférase de lapin	Abcam	ab21176
Anticorps anti-actine de souris	Sigma	A2066
Anti-VSV DE SOURIS M	N/A	N/A	Dr. John Connor (Université de Boston)
Anti-VACV de souris I3L	N/A	N/A	Dr. David Evans (Université de l’Alberta)
Plat chambré à 8 puits	Lab-Tek II	155409
Colorant de viabilité cellulaire	Thermo Fisher	C12881
Lecteur de microplaques FLUOstar	BMG Labtech	FLUOstar
Microscope confocal	Olympus	FV10i-LIV
Logiciel d’analyse d’images	Olympus	v1.18	logiciel cellSens Centrifugeuse
ventilée Eppendorf 5702	Eppendorf	22628102
Odyssey Fc	Li-COR Biosciences	Odyssey Fc
LD652 cellules	N/A	N/A	Dr. Basil Arif (Ressources naturelles Canada)
Cellules BSC-40	ATCC	CRL-2761
Cellules BHK	ATCC	CCL-10
Cellules HeLa	ATCC	CCL-2 BSC-1
cellules	ATCC	CCL-26
in vitro kit de transcription et de purification	Thermo Fisher	AM1626
Kit de purification PCR	Qiagen	Référence 28104