虫媒病毒感染作为鉴定病毒免疫调节剂和宿主抗病毒因子的筛选工具
Summary
在这里, 我们提出了识别 1) 病毒编码的免疫调节剂的协议, 以促进虫媒病毒复制和 2) 限制虫媒病毒复制的真核宿主因素。这些荧光和发光的方法, 使研究人员能够迅速获得定量读数的虫媒病毒复制在简单的检测, 低信噪比。
Abstract
RNA 干扰-和基因组编辑为基础的筛选平台已广泛用于识别宿主细胞因子, 限制病毒复制。然而, 这些屏幕通常进行的细胞, 自然纵容的病毒病原体正在研究中。因此, 在控制条件下的病毒的健壮复制可能会限制这些屏幕的动态范围。此外, 如果病毒适应宿主并能够抵抗抗病毒防御, 这些屏幕可能无法轻易识别出限制病毒复制的细胞防御通路。在本文中, 我们描述了一个新的范式, 以探索病毒宿主相互作用, 通过使用的屏幕, 中心的自然流产感染的虫媒病毒, 如水泡性口炎病毒 (VSV)。尽管 VSV 能够在广泛的 dipteran 昆虫和哺乳动物寄主中进行复制, VSV 还是经历了进入后, 在鳞翅目昆虫 (毒蛾) 的各种细胞系中流产后的感染。然而, 当宿主细胞抗病毒防御被破坏时, 这些流产的 VSV 感染可以被 “拯救”。我们描述如何 VSV 菌株编码方便的报告基因和限制性的L. 蛾细胞系可以配对设置屏幕, 以确定宿主因素参与虫媒病毒限制。此外, 我们还显示了这些筛选工具的效用, 以确定维拉利编码因素, 拯救 VSV 复制期间复合感染或通过异位表达, 包括那些编码的哺乳动物病毒。VSV 复制在L. 蛾细胞中的自然限制在筛选促进 VSV 救援的条件时提供了高信噪比, 从而使使用简单的荧光和荧光检测方法能够监测VSV 复制的更改。这些方法对于了解宿主抗病毒反应与病毒免疫规避因素之间的相互作用是有价值的。
Introduction
病毒在特定宿主中进行高效复制的能力, 部分取决于支持病毒输入和复制1的宿主细胞因子的可用性。病毒宿主范围也可以由病毒抵御细胞抗病毒防御的能力决定, 否则会阻碍病毒复制2,3。这是这些复杂的病毒宿主交互的结果, 最终决定病毒是否能够在特定主机上完成其生命周期。鉴于病毒复制的出现可能会对宿主造成致病性后果, 制定实验策略以进一步了解可能导致流产和生产效率平衡的关键病毒宿主相互作用至关重要。感染。阐明病毒宿主相互作用的分子特征将有助于制定新的和替代的抗病毒治疗策略。
随着 RNA 干扰 (核糖核酸)4、5和基因组编辑工具 (CRISPR-Cas9、锌指核酸、TALENs)6、7的出现, 改变细胞因子在全基因组范围内的表达, 并探讨这些改变对病毒复制的影响。事实上, 在无脊椎动物和脊椎动物宿主细胞类型中进行了大量的基于 rna 和基因组编辑的屏幕, 揭示了病毒宿主相互作用的新方面8、9、10,11,12. 这些屏幕通常使用病毒编码的记者, 如萤火虫荧光素酶 (卢克) 或荧光蛋白 (e., GFP, DsRed), 提供了方便的手段定量评估病毒基因表达作为一个读数病毒复制9,12。这一策略允许研究人员确定宿主因素, 它们要么促进或拮抗病毒复制, 在病毒报告信号9,12中分别增加或减少。然而, 在绝大多数情况下, 这些屏幕使用的病毒是很好地适应了他们正在研究的宿主细胞类型。虽然这一策略对于理解病毒病原体及其自然宿主之间的进化关系是很重要的, 但对于它们在揭示宿主抗病毒因子方面的应用却构成了根本的担忧。在这些情况下, 正在寻找病毒报告器上的信号增强, 或者是一种通常会阻碍病毒复制的细胞因子的失活。首先, 如果病毒已经能够在控制条件下检查的宿主细胞中进行强力复制, 则屏幕的动态范围 (即区分背景和增强的病毒报告信号的能力) 可能会受到限制。第二, 这个问题进一步复杂化的情况下, 病毒是良好的适应宿主细胞, 并有效地对抗主机防御路径, 是在屏幕上的目标。
由于上述对传统病毒宿主交互筛选方法的关注, 我们开发了一种新的模式来研究病毒宿主相互作用, 利用鳞翅目昆虫细胞中自然流产的虫媒病毒感染。这一策略来源于一项观察, 即研究良好的人类虫媒病毒, VSV, 在来自吉普赛蛾 (L. 蛾)13的细胞中经历了一次流产感染。VSV 是自然传播的 dipteran 昆虫 (即, 沙蝇) 的哺乳动物宿主, 并已证明实验性感染广泛的无脊椎动物和脊椎动物宿主在细胞培养和体内14。VSV 的 11 kb 负感单链 RNA 基因组编码五 subgenomic 基因, 它们分别转化为构成包络病毒的蛋白质。然而, VSV 反向遗传系统已经允许创建复制能力的菌株编码卢克或荧光蛋白, 除了五自然 VSV 基因产品15,16,17。由于这些记者的蛋白质没有纳入 VSV 病毒, 他们提供了一个方便的读数 VSV 基因表达, 发生后进入。我们以前曾表明, 使用 VSV 菌株编码 GFP 或卢克, VSV 基因表达严重限制在 LD652 细胞的进入, VSV 的滴度不会增加72小时后感染 (hpi)。相比之下, LD652 细胞与 VSV 和哺乳动物痘, 痘苗病毒 (VACV) 的复合感染, 导致在 VSV 基因表达和效价的这一时间点的对数增加。VACV 在 LD652 细胞感染中经历早期基因表达、DNA 复制和晚期基因表达, 但 VACV 复制周期最终由于不完全病毒形态发生18而流产。VACV 编码 > 200 蛋白的大 ~ 192 kb DNA 基因组, 其中许多显示免疫调节特性, 通过抑制宿主免疫应答19来促进病毒复制。因此, 我们假设 VACV 复合感染在 LD652 细胞中 VSV 复制的 “营救” 可能是由 VACV 免疫调节剂引起的, 抑制L. 蛾响应通常限制 VSV 复制。为支持这一点, LD652 细胞与宿主 RNA 聚合酶 II 抑制剂放线菌 D 的治疗也拯救 VSV 在 LD652 细胞复制, 表明转录依赖主机响应阻止 VSV 复制后进入13。
上述观察表明, LD652 细胞对 VSV 感染的自然限制性, 在筛选增强 VSV 编码的报告信号的条件时可能提供相对较低的背景 (即那些抑制宿主抗病毒防御)。在这里, 我们提供的方法, 以荧光或卢克为基础的化验, 以筛选条件, 以缓解 VSV 限制鳞翅目细胞。首先, 我们展示了如何使用这些检测方法来识别维拉利编码的免疫调节因子, 在复合感染实验中或通过候选病毒因子的异位表达打破 VSV 限制。举例来说, 我们说明了我们如何使用这些筛选技术来识别痘编码的 A51R 蛋白作为一种新的免疫调节因子家族, 在没有其他痘因素13的情况下拯救 VSV 复制。其次, 我们说明了如何在限制性 VSV-LD652 细胞感染中进行 rna 干扰筛选, 以直接识别虫媒病毒限制13中所涉及的真核宿主因素。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了简单的荧光和发光的检测, 以筛选条件, 拯救 VSV 复制在限制性的鳞翅目细胞培养。VSV 在鳞翅目细胞中的流产感染在 VSV 基因表达的检测中产生了良好的信噪比。例如, 裂解物从单 VSV 感染中检测到的 LU 信号比模拟感染的裂解物高1000倍, 然而这些信号在72小时的时间内只改变了大约两个。相比之下, VSV 的复合感染与 VACV 增强的 LU 信号相比, 300 倍于单 VSV-卢克感染 72 hpi。因此, VSV 救…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
危险品得到了德克萨斯大学西南医学中心资助的学者计划提供的资金支持。作者感谢迈克尔 Whitt (田纳西州大学健康科学中心) 和肖恩. 惠兰 (哈佛医学院) 提供 VSV-DsRed 和 VSV-卢克。作者还感谢加里 Luker (密歇根大学医学院) 为 VACV–FL-GFP 菌株的亲切礼物。
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
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