Arbovirus infektioner som Screening-værktøjer for identifikation af Viral hæmmende og vært Antiviral faktorer
Summary
Vi præsenterer her, protokoller for at identificere 1) virus-kodet hæmmende, der fremmer arbovirus replikering og 2) eukaryote vært faktorer, der begrænser arbovirus replikation. Disse fluorescens – og luminescens-baserede metoder giver forskere hurtigt få kvantitative udlæsninger af arbovirus replikering i forsimplede assays med lavt signal-støj-forhold.
Abstract
RNA interferens- og genom redigering-baseret screening platforme har været meget anvendt til at identificere vært celle faktorer, der begrænser virus replikering. Disse skærme foregår typisk i celler, der er naturligt eftergivende til viral patogenet under undersøgelsen. Derfor, den robuste replikering af virus i kontrol betingelser kan begrænse det dynamiske område af disse skærme. Desuden kan disse skærme kunne nemt identificere cellulære forsvar veje, der begrænser virus replikering, hvis virus er veltilpasset til værten og i stand til at imødegå antiviral forsvar. I denne artikel vil beskrive vi et nyt paradigme for at udforske virus-værtssammenspil ved hjælp af skærme, at centrum på naturligt mislykkede infektioner af arboviruses såsom vesikulær stomatitis-virus (VSV). Trods VSV evne til at formere sig i en bred vifte af tovingede insekter og pattedyr værter gennemgår VSV en post post, mislykkede infektion i en række cellelinier stammer fra Lepidoptera insekter, som sigøjner møl (Lymantria dispar). Men disse forfejlede VSV infektioner kan blive “reddet” når værten celle antiviral forsvar er kompromitteret. Vi beskriver, hvordan VSV stammer kodning praktisk reporter gener og restriktive L. dispar cellelinjer kan parres set-up skærme til at identificere vært faktorer involveret i arbovirus begrænsning. Derudover viser vi også nytte af disse værktøjer, screening i identifikation af viralt kodede faktorer, der redde VSV replikering under coinfection eller gennem Ektopisk udtryk, herunder kodet af pattedyr vira. Den naturlige begrænsning af VSV replikering i L. dispar celler giver et højt signal / støj-forhold ved screening for de betingelser, der fremmer VSV redning, således at brugen af forenklede luminescence – og fluorescens-baseret assays til at overvåge ændringer i VSV replikering. Disse metoder er værdifulde for at forstå samspillet mellem vært antiviral svar og viral immun unddragelse faktorer.
Introduction
Mulighed for en virus at produktivt replikere i en bestemt host er delvis omfattet af tilgængeligheden af vært celle faktorer, der understøtter viral entry og replikering1. Virus-værtsspektrum kan også være dikteret af kapacitet af en virus til counter cellulære antiviral forsvar, der ville ellers hæmmer viral replikation2,3. Det er resultatet af disse komplekse virus-værtssammenspil, der i sidste ende beslutte om en virus vil være i stand til at fuldføre sin livscyklus i en bestemt host. Givet de potentielt patogene konsekvenser for værten, hvis virusreplikation ensues, er det afgørende at udvikle eksperimenterende strategier til at fremme vores forståelse af de centrale virus-værtssammenspil, der kan tip balancen mellem forfejlede og produktive infektioner. Belyse de molekylære funktioner for virus-værts samspil vil være medvirkende til udviklingen af nye og alternative antiviral terapeutiske strategier.
Med fremkomsten af RNA interferens (RNAi)4,5 og genom-redigering værktøj (fx., CRISPR-Cas9, zink finger nukleaser, TALENs)6,7, det er blevet eksperimentelt muligt at ændre den udtryk for cellulære faktorer på genome-wide skalaer og udforske virkningerne af disse ændringer på virus replikering. Faktisk, mange RNAi og genom-redigering-baserede skærme er blevet ført i hvirvelløse og hvirveldyr vært celletyper, der har afsløret nye facetter af virus-vært interaktioner8,9,10, 11 , 12. disse skærme anvender typisk virus kodning reportere, såsom firefly luciferase (LUC) eller fluorescerende proteiner (fx., normal god landbrugspraksis, DsRed), der giver bekvem måde kvantitativt vurdere viral genekspression som en udlæsning for viral replikation9,12. Denne strategi gør det muligt for forskerne at identificere vært faktorer, som enten fremme eller irritere viral replikation, som det fremgår af stigninger eller fald, henholdsvis, i viral reporter signaler9,12. Men i langt de fleste tilfælde, disse skærme er blevet gennemført ved hjælp af vira, der er tilpasset den vært celletype, hvor de er ved at blive undersøgt. Denne strategi kan være vigtigt for at forstå coevolutionary relationer mellem virale patogener og deres naturlige værter, udgør det grundlæggende bekymringer med hensyn til deres anvendelse i afsløring vært antiviral faktorer. I disse tilfælde, en forbedring i virus reporter signal på RNAi knockdown betragtes for eller inaktivering af et cellulære faktor, der normalt hindrer viral replikation. Først, hvis en virus er allerede håndfast replicere i cellen vært undersøges under kontrol betingelser, det dynamiske område af skærmen (dvs, evne til at skelne mellem baggrund og øget viral reporter signaler) kan være begrænset. For det andet, dette spørgsmål er yderligere forværret af de situationer, hvor virus er veltilpasset til cellen vært og effektiv til bekæmpelse vært forsvar veje, der er at være målrettet i skærmen.
På grund af de ovennævnte betænkeligheder vedrørende traditionelle virus-vært interaktion screening-metoder, udviklet vi et nyt paradigme for at studere virus-værtssammenspil, der udnytter naturligt mislykkede arbovirus infektioner i Lepidoptera insekt celler. Denne strategi stammer fra en observation, at den velundersøgte menneskelige arbovirus, VSV, gennemgår en mislykkede infektion i celler, der stammer fra sigøjner møl (L. dispar)13. VSV er naturligvis overføres af tovingede insekter (dvs, sand fluer) til pattedyr værter, og har været vist eksperimentelt at inficere en bred vifte af hvirvelløse og hvirveldyr værter i celle kultur og i vivo14. 11-kb negative-følelse enkeltstrenget RNA genom af VSV koder fem subgenomic mRNAs, der hver oversat til de proteiner, der udgør den indhyllede virion. VSV omvendt genetiske systemer har tilladt for oprettelsen af replikationskompetente stammer kodning LUC eller fluorescerende proteiner, ud over de fem naturlige VSV gen produkter15,16,17. Fordi disse reporter proteiner ikke indgår i VSV virion, giver de en bekvem udlæsning til VSV genekspression, der opstår efter indrejse. Ved hjælp af VSV stammer kodning normal god landbrugspraksis eller LUC, har vi tidligere vist at VSV genekspression er alvorligt begrænset træder i LD652 celler og at VSV titers ikke øger af 72 timer efter infektionen (hpi). Derimod fører coinfection LD652 celler med VSV og pattedyr poxvirus, vaccinia virus (VACV), til logaritmisk stigninger i både VSV genekspression og titers fra dette tidspunkt. VACV gennemgår tidlige genekspression, DNA-replikation og sen Gen-ekspression i LD652 celler infektioner, men VACV replikering cyklus er i sidste ende forfejlede på grund af ufuldstændige virion morfogenese18. Den store ~ 192 kb DNA genom af VACV koder > 200 proteiner, hvoraf mange vise immunmodulerende egenskaber, der fremmer virusreplikation gennem undertrykkelse af vært immunrespons19. Derfor, vi hypotese at “redning” af VSV replikation i LD652 celler ved VACV coinfection var sandsynligvis medieret af VACV hæmmende, der hæmmede L. dispar svar normalt begrænser VSV replikering. Til støtte for dette redder behandling af LD652 celler med værten RNA polymerase II hæmmer actinomycin D også VSV replikation i LD652 celler, der angiver, at transskription-afhængige vært svar blokere VSV replikering efter posten13.
De ovenstående bemærkninger foreslår, at den naturligvis restriktive karakter af LD652 celler til VSV infektion kan give en relativt lav baggrunden når screening for de betingelser, der forbedrer VSV-kodet reporter signaler (dvs., dem der hæmmer vært antiviral forsvar). Her, leverer vi metoder til brug af fluorescens eller LUC-baserede assays til skærmen for forhold, der lindre VSV begrænsning i Lepidoptera celler. Først, viser vi, hvordan disse assays kan bruges til at identificere viralt kodede immunmodulerende faktorer, der bryder VSV begrænsning under enten coinfection eksperimenter eller gennem Ektopisk udtryk for kandidat viral faktorer. Som et eksempel illustrerer vi, hvordan vi brugt disse screening teknikker til at identificere poxvirus-kodet A51R proteiner som en ny familie af immunmodulerende faktorer, der redde VSV replikering i mangel af andre poxvirus faktorer13. For det andet, vi illustrere, hvordan RNAi screening i restriktive VSV-LD652 celle infektioner kan bruges til direkte identificere eukaryote vært faktorer involveret i arbovirus begrænsning13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet simpel fluorescens – og luminescens-baserede assays til at screene for forhold, der redde VSV replikering i restriktive Lepidoptera cellekulturer. Den forfejlede infektion af VSV i Lepidoptera celler skaber en fremragende signal / støj-forhold når kørsler for VSV genekspression. For eksempel, LU signaler registreret i lysates fra enkelt VSV-LUC infektioner var ~ 1.000-fold højere end i mock-inficeret lysates, men disse signaler kun ændret ca dobbelt over en 72-h tidsforløb. Derimod coinfection …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. blev støttet af midler fra University of Texas Southwestern Medical Centers begavet lærde Program. Forfatterne takke Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) og Sean Whelan (Harvard Medical School) for levering af VSV-DsRed og VSV-LUC. Forfatterne også takke Gary Luker (University of Michigan medicinsk skole) for den slags gave af VACV-FL-NGL stamme.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
References
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
- McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
- Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).
- Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
- Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
- Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
- Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
- Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).
- Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
- Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
- Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
- Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
- Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
- Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
- Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
- Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).
- Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
- Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190 (2013).
- Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
- Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).
