Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Summary

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie – en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Abstract

RNA-interferentie- en genoom bewerken gebaseerde screening platformen hebben wijd gebruikt factoren te identificeren host cel die replicatie van het virus te beperken. Deze schermen worden echter meestal uitgevoerd in cellen die natuurlijk vrijblijvend naar de virale pathogen bestudeerde zijn. Dus, de robuuste replicatie van virussen in controlevoorwaarden kan het beperken van het dynamisch bereik van deze schermen. Bovendien, deze schermen kunnen zijn niet gemakkelijk identificeren Cellulaire verdediging trajecten die virus replicatie te beperken als het virus is goed aangepast aan de host en staat voor het tegengaan van antivirale verdedigingen. In dit artikel beschrijven we een nieuw paradigma voor het verkennen van virus-gastheer interacties door het gebruik van schermen die midden op natuurlijk mislukte infecties door arboviruses zoals vesiculaire stomatitis-virus (VSV). Ondanks de mogelijkheid van VSV te repliceren in een brede waaier van dipteran insecten en zoogdieren hosts, ondergaat VSV een infectie na binnenkomst, mislukte in een verscheidenheid van cellijnen afgeleid van Lepidoptera insecten, zoals de plakker (Lymantria dispar). Echter, deze mislukte VSV-infecties kunnen worden “gered” toen host cel antivirale verdediging in het gedrang komt. We beschrijven hoe VSV stammen coderen handige reporter genen en beperkende L. dispar cellijnen kunnen worden gekoppeld aan set-up schermen gastheer factoren die betrokken zijn bij arbovirus beperking te identificeren. Bovendien laten we ook zien het nut van deze screening-programma’s in de identificatie van viraal gecodeerde factoren die VSV replicatie tijdens wordt of via ectopische expressie redden, met inbegrip van die gecodeerd door zoogdieren virussen. De natuurlijke beperking van VSV replicatie in L. dispar cellen biedt een hoge signaal-/ ruisverhouding wanneer screening voor de voorwaarden ter bevordering van de VSV redding, waardoor het gebruik van simplistische luminescentie en fluorescentie-gebaseerde testen om te controleren de veranderingen in de VSV replicatie. Deze methoden zijn waardevol voor het begrijpen van de interactie tussen gastheer antivirale reacties en virale immuun belastingontduiking factoren.

Introduction

Het vermogen van een virus om productief te repliceren in een bepaalde host wordt gedeeltelijk beheerst door de beschikbaarheid van de ontvangende cel factoren die ondersteuning bieden voor virale ingang en replicatie¹. Het virus-gastheer bereik kan ook worden bepaald door de capaciteit van een virus aan teller cellulaire antivirale verdediging die virale replicatie^2,3anders zouden hinderen. Het is het resultaat van deze complexe virus-gastheer interacties die uiteindelijk beslissen of een virus zal zitten kundig voor voltooien hun levenscyclus in een bepaalde host. Gezien de potentieel pathogene gevolgen voor de host als volgt van de virale replicatie, is het cruciaal voor de experimentele strategieën ter bevordering van ons begrip van de belangrijkste virus-gastheer interacties die het evenwicht tussen mislukte en productieve kan tip infecties. Het ophelderen van de moleculaire eigenschappen van virus-gastheer interactie zullen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe en alternatieve antivirale therapeutische strategieën.

Met de komst van RNA interferentie (RNAi)^4,5 en genoom-bewerkingsgereedschap (bv., CRISPR-Cas9, zink vinger nucleasen, TALENs)^6,7, is het geworden experimenteel haalbaar is om te veranderen de expressie van cellulaire factoren op de genoom-brede schalen en verken de impact van deze veranderingen over de replicatie van het virus. Inderdaad, talrijke RNAi en genoom bewerken-gebaseerde schermen hebben plaatsgevonden in ongewervelde en gewervelde gastheer celtypen die hebben onthuld nieuwe facetten van virus-gastheer interacties^{8,9,10, 11 , 12}. deze schermen gebruiken meestal virussen codering verslaggevers, zoals firefly luciferase (LUC) of fluorescerende eiwitten (bv., GFP, DsRed), die voorzien in handige middelen kwantitatief beoordeling van virale genexpressie als een uitlezing voor virale replicatie^9,12. Deze strategie kan onderzoekers gastheer factoren die ofwel bevorderen of virale replicatie jent blijkens stijgingen of dalingen, respectievelijk, in virale verslaggever^{9,12 signalen}te identificeren. Echter in de overgrote meerderheid van de gevallen, zijn deze schermen uitgevoerd met behulp van virussen die goed aangepast zijn aan de gastheer celtype waarin ze worden bestudeerd. Terwijl deze strategie kunnen van belang zijn voor het begrijpen van coevolutionary relaties tussen virale pathogenen en hun natuurlijke gastheren, vormt het fundamentele bezorgdheid met betrekking tot hun gebruik in blootleggen host antivirale factoren. In deze gevallen een verbetering in virus verslaggever signaal op RNAi knockdown is worden gezocht, of de inactivering van een cellulaire factor die normaal virale replicatie belemmert. Ten eerste, als een virus nog kan krachtig repliceren in de gastheercel bestudeerd onder omstandigheden van de controle, het dynamisch bereik van het scherm (dat wil zeggen, het vermogen om te onderscheiden tussen achtergrond en verbeterde virale verslaggever signalen) kan worden beperkt. Ten tweede, deze kwestie wordt verder verergerd door de situaties waarin het virus is goed aangepast aan de gastheercel en effectief in het tegengaan van host defense trajecten die worden gericht in het scherm.

Als gevolg van de bovengenoemde problemen met betrekking tot de traditionele virus-gastheer interactie screeningmethoden, ontwikkelden we een nieuw paradigma voor de studie van virus-gastheer interacties die misbruik maken van natuurlijk mislukte arbovirus infecties in Lepidoptera insect cellen. Deze strategie is afgeleid van een opmerking dat het goed bestudeerde menselijke arbovirus, VSV, een mislukte infectie in cellen die zijn afgeleid van de plakker (L. dispar)^{13 ondergaat}. VSV Natuurlijk wordt overgebracht door dipteran insecten (d.w.z., zand vliegt) naar zoogdieren hosts en experimenteel is aangetoond dat het infecteren van een breed scala van ongewervelden en gewervelde gastheren, beide in cel cultuur en in vivo¹⁴. De 11-kb negatieve-zin single-stranded RNA genoom van VSV codeert vijf subgenomic mRNAs die zijn elk vertaald in de eiwitten waaruit de omhuld virion. VSV omgekeerde genetische systemen hebben echter toegestaan voor de oprichting van replicatie-bevoegde stammen codering LUC of fluorescerende eiwitten, naast de vijf natuurlijke VSV gene producten^15,16,17. Omdat deze verslaggever proteïnen niet in de VSV virion opgenomen zijn, bieden ze een gemakkelijke uitlezing voor VSV genexpressie dat zich na binnenkomst voordoet. Met behulp van VSV stammen codering GFP of LUC, hebben wij eerder getoond dat VSV genexpressie beperkt bij de binnenkomst van LD652 cellen is en dat VSV titers niet door 72 uur na infectie (hpi verhogen). In tegenstelling, leidt het wordt LD652 cellen met VSV en de zoogdieren poxvirus, vacciniavirus (VACV), tot logaritmische stijgingen van zowel de VSV genexpressie en de titers door dit punt van tijd. VACV ondergaat vroege expressie van genen, DNA-replicatie en laat genexpressie in LD652 cel infecties, maar de VACV-replicatiecyclus is uiteindelijk mislukte als gevolg van onvolledige virion morfogenese¹⁸. Het grote ~ 192-kb DNA-genoom van VACV codeert > 200 eiwitten, waarvan vele immunomodulerende eigenschappen ter bevordering van de virale replicatie via de onderdrukking van de host immuunrespons¹⁹weergeven. Dus veronderstelde we dat de “redding” van VSV replicatie in LD652 cellen door VACV wordt was waarschijnlijk gemedieerd door VACV immunomodulators die geremd L. dispar reacties normaal beperken VSV replicatie. Ter ondersteuning van dit redt de behandelingvan LD652 cellen met de host RNA polymerase II remmer actinomycin D ook replicatie van de VSV in LD652 cellen, die aangeeft dat de reacties van de transcriptie-afhankelijke host na binnenkomst¹³van de replicatie van de VSV blokkeren.

De bovenstaande opmerkingen suggereren dat de natuurlijk beperkende aard van LD652 cellen aan VSV-infectie een relatief lage achtergrond voorschrijven kan wanneer screening voor de voorwaarden die verbeteren verslaggever VSV-gecodeerde signalen (dat wil zeggen, degenen die een remmende werking van host antivirale verdediging). Wij bieden hier, de methoden voor het gebruik van fluorescentie- of LUC gebaseerde testen naar scherm voorwaarden die VSV beperking in Lepidoptera cellen verlichten. Ten eerste, laten we zien hoe deze gehaltebepalingen factoren te identificeren viraal gecodeerde immunomodulerende die VSV beperking tijdens beide experimenten wordt of via ectopische expressie van kandidaat-virale factoren breken kunnen worden gebruikt. Als voorbeeld illustreren we hoe we deze screening technieken gebruikt om te identificeren poxvirus-gecodeerde A51R eiwitten als een nieuwe familie van immunomodulerende factoren die VSV replicatie in het ontbreken van andere factoren poxvirus¹³te redden. Ten tweede, we illustreren hoe RNAi screening in beperkende VSV-LD652 cel infecties kan worden gebruikt voor direct identificatie eukaryotische gastheer factoren die betrokken zijn bij arbovirus beperking¹³.

Protocol

1. algemene Lymantria dispar (LD652) cel en Virus cultuur LD652 cel kweken en plating Aan cultuur L. dispar-afgeleide cellen van de LD652, een monolayer van cellen in een groeimedium (Tabel of Materials) geïncubeerd bij 27 ° C onder normale sfeer behouden. Handhaven van de cellen in 10 cm weefsel-cultuur-testgroep gerechten en passage van de cellen bij het 80% confluentie bereiken. Plaat, verjagen Adherente cellen van de LD652 …

Representative Results

Als een voorbeeld van live-cel weergavetoepassingen om te controleren van VSV redding op VACV wordt, LD652 cellen werden verguld in een 8-well chambered schotel en vervolgens mock-besmet of besmet met VSV-DsRed (MOI = 1) in de aanwezigheid of afwezigheid van VACV-FL-GFP (MOI = 25). Omdat VSV-DsRed DsRed als een vrije eiwit spreekt en niet aan VSV-structurele eiwitten (figuur 1A) is gesmolten, is het alleen gedetecteerd nadat VSV ingang en gen-expressie start….

Discussion

Wij hebben hier eenvoudige fluorescentie – en luminescentie gebaseerde testen te screenen op omstandigheden die VSV replicatie in beperkende Lepidoptera celculturen redden beschreven. De mislukte infectie van VSV in Lepidoptera cellen maakt een uitstekende signal-to-noise verhouding als keuring voor VSV genexpressie. Bijvoorbeeld, de LU-signalen gedetecteerd in lysates uit één VSV-LUC infecties waren ~ 1,000-fold hoger dan in mock-geïnfecteerde lysates, maar deze signalen ongeveer tweeledig alleen gewijzigd in de tijd…

Materials

6-well tissue culture plates	CELLTREAT	229106
24-well tissue culture plates	CELLTREAT	229124
10 cm tissue culture dishes	Corning	C430167
Grace’s Insect Medium	Sigma	G8142
EX-CELL 420	Sigma	14420C
Fetal Bovine Serum – Optima	Atlanta Biologicals	S12450
Growth medium			1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)	Sigma	A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma	D8662
Serum Free Media (SFM)	Thermo Fisher	10902096
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Transfection reagent	Thermo Fisher	10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25950CQC
Reporter lysis buffer 5X	Promega	E3971
Luciferase Assay Reagent	Promega	E1483
96-Well Microplates	Corning	3915
Mouse anti-FLAG antibody	Wako	014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab21176
Mouse anti-actin antibody	Sigma	A2066
Mouse anti-VSV M	N/A	N/A	Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L	N/A	N/A	Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish	Lab-Tek II	155409
Cell viability dye	Thermo Fisher	C12881
FLUOstar microplate reader	BMG Labtech	FLUOstar
Confocal microscope	Olympus	FV10i-LIV
Image analysis software	Olympus	v1.18	cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge	Eppendorf	22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System	Li-COR Biosciences	Odyssey Fc
LD652 cells	N/A	N/A	Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells	ATCC	CRL-2761
BHK cells	ATCC	CCL-10
HeLa cells	ATCC	CCL-2
BSC-1 cells	ATCC	CCL-26
in vitro transcription and purification kit	Thermo Fisher	AM1626
PCR purification kit	Qiagen	28104