Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
Abstract
RNA – Interferenz und Genom Bearbeitung-basierten screening-Plattformen haben weit verbreitet, Host Zelle Faktoren identifizieren, die Replikation des Virus zu beschränken. Jedoch sind diese Bildschirme in der Regel in Zellen durchgeführt, die natürlich permissive auf die virale Erreger untersucht werden. Daher kann die robuste Replikation von Viren bei Kontrolle den Dynamikbereich der beiden Bildschirme beschränken. Darüber hinaus können diese Bildschirme möglicherweise nicht zelluläre Abwehr Wege leicht zu identifizieren, die Replikation des Virus zu beschränken, wenn das Virus gut angepasst, um den Host und in der Lage, die Bekämpfung der antiviralen Abwehr ist. In diesem Artikel beschreiben wir ein neues Paradigma für die Erkundung von Virus-Wirt Interaktionen durch den Einsatz von Bildschirmen, die Mitte auf natürlich abortive Infektionen durch Arboviren z. B. vesikuläre Stomatitis Virus (VSV). Trotz der Möglichkeit des VSV, in einer Vielzahl von Dipteren Insekten und Säugetieren Hosts zu replizieren erfährt VSV eine Post-Eintrag, abortive Infektion in einer Vielzahl von Zelllinien aus Lepidoptera Insekten, wie z. B. der Schwammspinner (Lymantria dispar). Jedoch können diese abortiven VSV-Infektionen “gerettet werden” beim Wirt Zelle antiviralen Abwehr beeinträchtigt werden. Wir beschreiben, wie VSV Codierung bequem Reporter-Gene und restriktive L. Dispar Stämme Zelllinien können kombiniert werden, um Setup-Bildschirme, Host Faktoren beteiligt Arboviren Einschränkung zu identifizieren. Darüber hinaus zeigen wir auch die Nützlichkeit dieser Screening-Tools bei der Identifizierung von Viral codierten Faktoren, die VSV-Replikation während Coinfection oder durch ektopische Expression, einschließlich derer von Säugetieren Viren kodiert zu retten. Die natürliche Einschränkung der VSV-Replikation in L. Dispar Zellen bietet ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis beim screening für die Bedingungen, die Förderung der VSV Rettung, so dass die Verwendung von simpel Lumineszenz und Fluoreszenz-basierende Assays zu überwachen die Änderungen in der VSV-Replikation. Diese Methoden sind wertvoll für das Zusammenspiel zwischen Host antivirale Reaktionen und viral immune Evasion Faktoren zu verstehen.
Introduction
Die Fähigkeit eines Virus, produktiv in einem bestimmten Host replizieren wird teilweise durch die Verfügbarkeit von Host Cell Faktoren geregelt, die virale Eintrag und Replikation1unterstützen. Virus-Wirtsspektrums kann auch durch die Kapazität eines Virus zu zellulären antiviralen Abwehr Zähler diktiert werden, die virale Replikation2,3sonst behindern würde. Es ist das Ergebnis dieser komplexen Virus-Wirt Interaktionen, die letztlich entscheiden, ob ein Virus in der Lage, seinen Lebenszyklus in einem bestimmten Host zu vervollständigen. Angesichts der potenziell pathogenen Folgen für den Host, wenn virale Replikation erfolgt, ist es wichtig, um unser Verständnis der wichtigsten Virus-Wirt Interaktionen zu fördern, das Zünglein an der Waage zwischen erfolglosen und produktive können experimentelle Strategien zu entwickeln Infektionen. Aufklärung der molekularen Merkmale der Virus-Wirt Zusammenspiel werden maßgeblich an der Entwicklung neuer und alternativer antivirale therapeutischer Strategien.
Mit dem Aufkommen der RNA-Interferenz (RNAi)4,5 und Genom-editing-Tools (zB., CRISPR-Cas9, Zink-finger-Nukleasen, TALENs)6,7, geworden es experimentell möglich, Ändern der Ausdruck der zellulären Faktoren auf genomweite skaliert und erkunden Sie die Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Virusreplikation. In der Tat, wurden zahlreiche RNAi und Genom-Bearbeitung-basierte Bildschirme in Wirbellosen und Wirbeltieren Host Zelltypen durchgeführt, die neue Facetten von Virus-Wirt Interaktionen8,9,10, enthüllt haben 11 , 12. diese Bildschirme beschäftigen in der Regel Viren Reporter, wie Glühwürmchen Luciferase (LUC) oder fluoreszierende Proteine kodieren (zB., GLP, DsRed), vorsehen, dass bequeme Mittel zur Bewertung der quantitativ virale Genexpression als einer Anzeige für die Virusreplikation9,12. Diese Strategie erlaubt Forschern, Host Faktoren zu identifizieren, die entweder zu fördern oder Virusreplikation antagonisieren ausweislich erhöht oder verringert, bzw., in virale Reporter9,12 Signale. Allerdings wurden in der überwiegenden Mehrheit der Fälle diese Bildschirme durchgeführt mit Viren, die gut angepasst, um den Host-Zelle-Typ sind, in denen sie untersucht werden. Während diese Strategie wichtig für das Verständnis der coevolutionary Beziehungen zwischen viraler Krankheitserreger und ihre natürlichen Wirte sein kann, stellt es grundsätzliche Bedenken in Bezug auf ihre Verwendung in Aufdeckung Host antiviralen Faktoren dar. In diesen Fällen eine Erweiterung in Virus Reporter signal auf RNAi Zuschlag gesucht wird oder die Inaktivierung eines zellulären Faktors, die normalerweise Virusreplikation behindert. Zuerst, wenn ein Virus bereits kräftig in der Wirtszelle untersucht unter Kontrolle Bedingungen zu replizieren, möglicherweise der dynamische Bereich des Bildschirms (d.h., die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Hintergrund und verbesserte virale Reporter Signale) beschränkt. Zweitens ist dieses Problem noch durch die Situationen verschärft, in denen das Virus ist gut angepasst an die Wirtszelle und effektiv bei der Bekämpfung von Host Verteidigung Bahnen, die auf dem Bildschirm abgezielt werden.
Aufgrund der oben genannten Bedenken hinsichtlich traditioneller Virus-Wirt-Interaktion screening-Verfahren entwickelten wir ein neues Paradigma für das Studium von Virus-Wirt Interaktionen, die natürlich abortiven Arboviren Infektionen in Lepidoptera Insektenzellen ausnutzen. Diese Strategie ergibt sich aus einer Beobachtung, dass die gut untersuchten menschlichen Arboviren, VSV, eine abortive Infektion in Zellen aus der Schwammspinner (L. dispar)13 erfährt. VSV ist natürlich durch Dipteren Insekten (z.B. Sandfliegen) an Säugetieren Hosts übertragen und wurde experimentell gezeigt, dass eine Vielzahl von Wirbellosen zu infizieren und Wirbeltiere Gastgeber in Zell-Kultur und in-Vivo–14. 11-kb negativen Sinn einsträngige RNA-Genom der VSV kodiert fünf Subgenomic mRNAs, die jeweils in Proteine übersetzt werden, aus denen das behüllte Virion besteht. Allerdings haben VSV reverse genetische Systeme für die Erstellung von Replikation zuständigen Stämme LUC oder fluoreszierende Proteine, zusätzlich zu den fünf natürlichen VSV gen Produkte15,16,17-Codierung erlaubt. Weil diese Reporter Proteine der VSV Virion nicht integriert sind, bieten sie eine bequeme Auslesen für VSV-gen-Expression, die Post-Eintrag auftritt. VSV-Stämme, die GFP oder LUC-Codierung verwenden, haben wir zuvor gezeigt, dass VSV Genexpression bei der Einreise von LD652 Zellen stark eingeschränkt ist, VSV-Titer nicht von 72 Stunden nach der Infektion (Hpi) erhöhen. Im Gegensatz dazu führt Coinfection LD652 Zellen mit VSV und der Säugetier-Poxvirus, Vaccinia Virus (VACV), zu logarithmischen VSV Genexpression und Titer von diesem Zeitpunkt. VACV erfährt frühen Genexpression, DNA-Replikation und späten Genexpression in LD652 Zelle Infektionen, aber der VACV Replikationszyklus ist letztlich gescheiterten aufgrund unvollständiger Virion Morphogenese18. Der große ~ 192-kb-DNA-Genom des VACV kodiert > 200 Proteine, von die viele immunmodulatorische Eigenschaften anzuzeigen, die virale Replikation durch die Unterdrückung der Host Immunantworten19zu fördern. Daher wir die Hypothese aufgestellt, die die “Rettung” der VSV-Replikation in LD652 Zellen durch VACV Coinfection wahrscheinlich durch VACV Immunmodulatoren vermittelt wurde, die L. Dispar Antworten normalerweise einschränken VSV Replikation gehemmt. Zur Unterstützung rettet die Behandlung von LD652 Zellen mit dem Host RNA Polymerase II Inhibitor Actinomycin D auch VSV Replikation in LD652 Zellen, die darauf hinweist, dass die Transkription-abhängigen Host Antworten VSV Replikation nach dem Eintrag13 Block.
Die obigen Beobachtungen legen nahe, dass die natürlich restriktive Charakter der LD652 Zellen, VSV-Infektion einen relativ niedrigen Hintergrund vorsehen, beim screening für die Bedingungen, die Reporter VSV-codierte Signale (d.h.diejenigen, die Host hemmen zu verstärken antiviralen Abwehr). Hier vermitteln wir die Methoden für die Verwendung von Fluoreszenz oder LUC basierende Assays zum Bildschirm für die Bedingungen, die VSV Einschränkung in Lepidoptera Zellen zu entlasten. Zunächst zeigen wir, wie diese Tests verwendet werden können, um Viral codierten immunmodulatorische Faktoren identifizieren, die VSV Einschränkung während der beiden Coinfection Experimente oder durch ektopische Expression von Kandidaten virale Faktoren zu brechen. Als Beispiel zeigen wir, wie wir diese Screening-Techniken verwendet, um Poxvirus-codierte A51R Proteine als eine neue Familie von immunmodulatorische Faktoren zu identifizieren, die VSV-Replikation in Abwesenheit von anderen Poxvirus Faktoren13zu retten. Zweitens zeigen wir, wie RNAi screening in restriktiven VSV-LD652 Zelle Infektionen verwendet werden kann, direkt Arboviren Einschränkung13eukaryotischen Host Faktoren identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir beschrieben, einfache Fluoreszenz und Lumineszenz-basierende Assays für die Bedingungen auf den Bildschirm, das VSV-Replikation in restriktiven Lepidoptera Zellkulturen zu retten. Die abortive Infektion des VSV in Lepidoptera Zellen erstellt ein ausgezeichnetes Signal-Rausch-Verhältnis beim VSV Genexpression zu prüfen. Zum Beispiel die LU-Signale in Lysaten aus einzelnen VSV-LUC Infektionen erkannt wurden ~ 1,000-fold höher als im Mock-infizierten Lysates, doch diese Signale nur etwa zweifach über ein…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. wurde unterstützt durch die Finanzierung von der University of Texas Southwestern Medical Center ausgestattet Scholars Program. Die Autoren danken Michael Whitt (The University of Tennessee Health Science Center) und Sean Whelan (Harvard Medical School) für die Bereitstellung von VSV-DsRed und VSV-LUC. Die Autoren danken auch Gary Luker (University of Michigan Medical School) für die freundlichen Gabe des VACV-FL-GFP-Stamm.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
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