Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

Summary

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Abstract

Interferenza di RNA – e genoma editing basato su piattaforme di screening sono stati ampiamente usati per identificare fattori di cellula ospite che limitano la replicazione del virus. Tuttavia, questi schermi sono in genere condotti in cellule che sono naturalmente permissive al patogeno virale in fase di studio. Di conseguenza, la robusta replicazione del virus in condizioni di controllo può limitare la gamma dinamica di queste schermate. Inoltre, questi schermi potrebbero essere Impossibile identificare facilmente i percorsi di difesa cellulare che limitano la replicazione del virus, se il virus è in grado di contrastare le difese antivirali e ben adattati all’host. In questo articolo, descriviamo un nuovo paradigma per esplorare le interazioni virus-ospite attraverso l’uso di schermi che centro a naturalmente abortite infezioni da arbovirus come virus della stomatite vescicolare (VSV). Nonostante la capacità di riprodursi in una vasta gamma di insetti Ditteri e ospita mammiferi dei VSV, VSV subisce un’infezione post-voce, abortita in una varietà di linee cellulari derivate da lepidotteri insetti come il bombice dispari (Lymantria dispar). Tuttavia, queste infezioni VSV abortive possono essere “salvate” quando le difese antivirali di cellula ospite sono compromesse. Descriviamo come VSV ceppi codifica geni reporter conveniente e restrittive dispar L. linee cellulari possono essere accoppiate agli schermi di messa a punto per identificare fattori dell’ospite coinvolti nella restrizione da arbovirus. Inoltre, mostriamo anche l’utilità di questi strumenti di screening nell’identificazione dei fattori viralmente codificati che replica VSV durante il coinfection o attraverso l’espressione ectopica, compresi quelli codificati dal virus dei mammiferi di soccorso. La limitazione naturale della replica di VSV in dispar L. cellule fornisce un elevato rapporto segnale-rumore quando lo screening per le condizioni che favoriscono il salvataggio VSV, consentendo in tal modo l’uso di metodi semplicistici luminescenza e fluorescenza-basata per monitorare le modifiche nella replica di VSV. Queste metodologie sono utili per comprendere l’interazione tra risposte antivirali ospite e fattori virali evasione immune.

Introduction

La capacità di un virus di replicare in modo produttivo in un particolare host è in parte regolata dalla disponibilità di fattori di cellula ospite che supportano entrata virale e replica¹. La gamma di virus-ospite può essere dettata anche dalla capacità di un virus a contatore antivirale le difese cellulari che altrimenti impedirebbero la replicazione virale^2,3. Esso è il risultato di queste interazioni virus-ospite complessi che in ultima analisi, decidere se un virus sarà in grado di completare il suo ciclo di vita in un particolare host. Dato le conseguenze potenzialmente patogene per l’host se ne deriva la replicazione virale, è fondamentale per sviluppare strategie sperimentali per avanzare la nostra comprensione delle interazioni virus-ospite chiave che l’ago della bilancia tra abortiti e produttivo infezioni. Chiarire le caratteristiche molecolari di interazione virus-ospite sarà determinante nello sviluppo di strategie terapeutiche antivirali nuove e alternative.

Con l’avvento di RNA interferenza (RNAi)^4,5 e strumenti di modifica del genoma (ad es., CRISPR-Cas9, zinco dito nucleasi, TALENs)^6,7, è diventato sperimentalmente fattibile per alterare la espressione di fattori cellulari sul genoma scale ed esplorare l’impatto di queste alterazioni sulla replicazione del virus. Infatti, sono stati condotti numerosi RNAi e genoma di editing basati su schermi in tipi di cellule ospite invertebrati e vertebrati che hanno svelato nuove sfaccettature del virus-ospite interazioni^{8,9,10, 11 , 12}. queste schermate di solito impiegano virus codifica reporter, come la luciferasi di lucciola (LUC) o proteine fluorescenti (ad es., GFP, DsRed), che forniscono comodo mezzo per valutare quantitativamente l’espressione genica virale come una lettura per la replicazione virale^9,12. Questa strategia permette ai ricercatori di identificare fattori ospite che sia promuovono o antagonizzano replicazione virale, come evidenziato da aumenti o diminuzioni, rispettivamente, virale Reporter segnala^9,12. Tuttavia, nella stragrande maggioranza dei casi, questi schermi sono stati condotti usando i virus che si siano ben adattati al tipo di cellula ospite in cui stanno studiandi. Mentre questa strategia può essere importante per comprendere le relazioni coevolutionary tra agenti patogeni virali e loro ospiti naturali, pongono fondamentali preoccupazioni per quanto riguarda il loro uso in scoprendo fattori antivirali dell’ospite. In questi casi, un miglioramento in reporter di virus segnale di RNAi atterramento è ricercato, o l’inattivazione di un fattore cellulare che normalmente impedisce la replicazione virale. In primo luogo, se un virus è già in grado di replicare con fermezza nella cellula ospite all’esame in condizioni di controllo, la gamma dinamica dello schermo (cioè, la capacità di distinguere tra sfondo e segnali reporter virale avanzata) può essere limitata. In secondo luogo, questo problema è ulteriormente aggravato dalle situazioni in cui il virus è ben adattato alla cellula ospite ed efficace nel contrastare le vie di difesa ospite che sono presi di mira nella schermata.

A causa delle preoccupazioni di cui sopra per quanto riguarda l’interazione virus-ospite tradizionali metodi di screening, abbiamo sviluppato un nuovo paradigma per lo studio delle interazioni virus-ospite che sfruttano le infezioni da arbovirus naturalmente abortiti in cellule di insetto lepidottero. Questa strategia deriva da un’osservazione che l’arbovirus umano ben studiata, VSV, subisce un’infezione abortita in cellule derivate dal lepidottero zingaresco (L. dispar)¹³. VSV è naturalmente trasmessa da insetti Ditteri (cioè, flebotomi) agli host dei mammiferi e ha dimostrato sperimentalmente di infettare una vasta gamma di invertebrati e vertebrati host sia in cella cultura ed in vivo¹⁴. Il genoma di 11-kb-senso single-stranded RNA di VSV codifica cinque mRNAs subgenomic che ciascuno si traducono in proteine che compongono il virione avvolta. Tuttavia, sistemi di genetica inverso VSV hanno permesso la creazione di ceppi replica-competente codifica LUC o proteine fluorescenti, oltre le cinque naturale VSV gene prodotti^15,16,17. Poiché queste proteine reporter non sono incorporate nel virione VSV, forniscono una lettura comoda per l’espressione genica VSV che si verifica post-voce. Utilizzo di ceppi VSV codifica GFP o LUC, precedentemente abbiamo indicato che l’espressione genica VSV è severamente limitato al momento dell’entrata delle cellule LD652 e che i titoli VSV non aumentano da post-infezione 72 ore (hpi). Al contrario, la coinfezione di cellule LD652 con VSV e mammiferi di poxvirus, virus vaccinico (VACV), conduce ad un aumento logaritmico sia espressione genica VSV ed i titoli da questo punto di tempo. VACV subisce precoce espressione genica, la replicazione del DNA e tardi espressione genica nelle infezioni delle cellule LD652, ma il ciclo di replica VACV è in definitiva abortito a causa di incompleta virione morfogenesi¹⁸. Il grande genoma DNA ~ 192 kb di VACV codifica proteine > 200, molti dei quali visualizzare proprietà immunomodulatorie che promuovono la replicazione virale attraverso la soppressione di host le risposte immunitarie¹⁹. Di conseguenza, abbiamo supposto che il “salvataggio” di replica VSV in cellule LD652 da coinfezione VACV probabilmente è stato mediato da immunomodulatori VACV che ha inibito dispar L. risposte normalmente limitando replica VSV. A sostegno di ciò, il trattamento delle cellule di LD652 con l’inibitore di host RNA polimerasi II actinomicina D salva anche replica VSV in cellule di LD652, che indica che la risposta dell’ospite di trascrizione-dipendente blocco VSV replica post-voce¹³.

Queste osservazioni indicano che la natura naturalmente restrittiva delle cellule di LD652 all’infezione di VSV può fornire uno sfondo relativamente basso quando lo screening per le condizioni che migliorare i segnali reporter VSV-codificati (cioè, quelli che inibiscono host difese antivirali). Qui, mettiamo a disposizione i metodi per l’utilizzo di fluorescenza o saggi basati su LUC alla schermata per condizioni che alleviano la restrizione di VSV in cellule di lepidotteri. In primo luogo, vi mostriamo come queste analisi possono essere utilizzate per identificare i fattori immunomodulatori viralmente codificato che rompono restrizione VSV durante entrambi gli esperimenti di coinfezione o attraverso l’espressione ectopica di fattori virali candidato. Ad esempio, vi illustriamo come abbiamo usato queste tecniche di screening per identificare proteine codificate poxvirus di A51R come una nuova famiglia di fattori immunomodulatori che replica VSV in assenza di altri fattori di poxvirus¹³di soccorso. In secondo luogo, vi illustriamo come RNAi di screening nelle infezioni di cella restrittive VSV-LD652 può essere utilizzato per identificare direttamente coinvolti da arbovirus restrizione¹³fattori dell’ospite eucariotica.

Protocol

1. generale Lymantria dispar (LD652) cella e cultura del Virus Cella LD652 coltura e placcatura Alla cultura dispar L.-derivata LD652 cellule, mantenere un monostrato di cellule in un mezzo di crescita (Tabella materiali) incubate a 27 ° C in atmosfera normale. Mantenere le cellule in piatti di tessuto-cultura-trattati di 10cm e passaggio le cellule giunti confluency di 80%. Piastra, sloggiare le cellule aderenti LD652 dalla pia…

Representative Results

Come un esempio di applicazioni di imaging di cellule vive per monitorare salvataggio VSV su coinfection VACV, LD652 cellule erano placcate in un piatto chambered 8 pozzetti e poi mock-infettati o infettate con VSV-DsRed (MOI = 1) in presenza o assenza di VACV-FL-GFP (MOI = 25). Perché VSV-DsRed esprime DsRed come una proteina libera e non è fusa delle proteine strutturali di VSV (Figura 1A), viene rilevato solo dopo avvia VSV voce e l’espressione genica. T…

Discussion

Qui abbiamo descritto analisi semplice di fluorescenza e luminescenza basata allo schermo per condizioni che replica VSV in colture cellulari di lepidotteri restrittive di soccorso. L’infezione abortita di VSV in cellule di lepidotteri crea un eccellente rapporto segnale-rumore quando analizzando per espressione genica VSV. Ad esempio, sono stati i segnali di LU rilevati nei lysates dalle singole infezioni VSV-LUC ~ 1.000 superiore a nei lysates mock-infettati, eppure questi segnali solo cambiato circa duplice sopra un c…

Materials

6-well tissue culture plates	CELLTREAT	229106
24-well tissue culture plates	CELLTREAT	229124
10 cm tissue culture dishes	Corning	C430167
Grace’s Insect Medium	Sigma	G8142
EX-CELL 420	Sigma	14420C
Fetal Bovine Serum – Optima	Atlanta Biologicals	S12450
Growth medium			1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)	Sigma	A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma	D8662
Serum Free Media (SFM)	Thermo Fisher	10902096
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Transfection reagent	Thermo Fisher	10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25950CQC
Reporter lysis buffer 5X	Promega	E3971
Luciferase Assay Reagent	Promega	E1483
96-Well Microplates	Corning	3915
Mouse anti-FLAG antibody	Wako	014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab21176
Mouse anti-actin antibody	Sigma	A2066
Mouse anti-VSV M	N/A	N/A	Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L	N/A	N/A	Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish	Lab-Tek II	155409
Cell viability dye	Thermo Fisher	C12881
FLUOstar microplate reader	BMG Labtech	FLUOstar
Confocal microscope	Olympus	FV10i-LIV
Image analysis software	Olympus	v1.18	cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge	Eppendorf	22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System	Li-COR Biosciences	Odyssey Fc
LD652 cells	N/A	N/A	Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells	ATCC	CRL-2761
BHK cells	ATCC	CCL-10
HeLa cells	ATCC	CCL-2
BSC-1 cells	ATCC	CCL-26
in vitro transcription and purification kit	Thermo Fisher	AM1626
PCR purification kit	Qiagen	28104