Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로
Summary
여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.
Abstract
RNA 간섭-및 편집-기반 플랫폼을 심사 하는 게놈 바이러스 복제를 제한 하는 호스트 셀 요소를 식별 하기 위해 널리 사용 되어 왔습니다. 그러나, 이러한 스크린 자연스럽 게 연구 바이러스 성 병원 체를 허용 하는 셀에 일반적으로 지휘 된다. 따라서, 제어 조건에 있는 바이러스의 강력한 복제 이러한 스크린의 동적 범위를 제한할 수 있습니다. 또한,이 화면 수 있습니다 수 없습니다 쉽게 식별할 세포 방어 경로 바이러스가 호스트에 잘 적응 하 고 대항 항 바이러스 방어의 경우 바이러스 복제를 제한 하는. 이 문서에서는, 우리는 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) arboviruses에 의해 자연스럽 게 조산 감염에 바이러스-호스트 상호 작용 센터 화면 사용을 탐험에 대 한 새로운 패러다임을 설명 합니다. Dipteran 곤충과 포유류 호스트의 넓은 범위에서 복제 VSV의 능력에도 불구 하 고 VSV는 집시 나 방 (Lymantria dispar)와 같은 lepidopteran 곤충에서 파생 된 세포 라인의 다양 한 후 항목, 조산 감염을 겪 습. 그러나, 이러한 조산 VSV 감염 수 수 “구출” 호스트 세포 항 바이러스 방어 손상 된 경우. 우리가 어떻게 VSV 긴장 인코딩 편리한 리포터 유전자와 제한적인 L. dispar 설명 셀 라인 호스트 요소 arbovirus 제한에 관련 된 식별을 설정 화면에 쌍이 될 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 coinfection 또는 포유류 바이러스에 의해 비롯 소성 표현을 통해 VSV 복제 구조 virally 인코딩된 요소의 식별 이러한 검사 도구 유틸리티를 보여줍니다. VSV 구조, 모니터를 단순한 발광 및 형광 기반 분석의 사용 활성화를 촉진 하는 조건에 대 한 심사 때 L. dispar 셀에 VSV 복제의 자연 제한 높은 신호 대 잡음 비율을 제공 VSV 복제의 변화입니다. 이러한 방법론은 호스트 항 바이러스 응답 바이러스 면역 회피 요인 사이 상호 작용을 이해 하는 데 중요 합니다.
Introduction
생산적으로 특정 호스트에 복제 하는 바이러스의 기능 바이러스 항목 및 복제1을 지 원하는 호스트 셀 요소의 가용성 부분에 적용 됩니다. 바이러스-호스트 범위 또한 카운터 세포 항 바이러스 방어 바이러스 성 복제2,3방해 그렇지 않으면 것을 바이러스의 용량에 의해 지시 될 수 있습니다. 그것은 궁극적으로 바이러스 특정 호스트에서의 라이프 사이클을 완료할 수 여부를 결정 하는 이러한 복잡 한 바이러스-호스트 상호 작용의 결과. 바이러스 성 복제 발생 하는 경우 호스트에 대 한 잠재적으로 병원 성 결과 감안할 때, 그것은 실패와 생산 사이의 균형 팁 수 있습니다 주요 바이러스-호스트 상호 작용에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 실험적인 전략을 개발 하는 중요 한 감염입니다. 바이러스-호스트 상호 작용의 분자 기능 elucidating 신규 및 대체 항 바이러스 치료 전략의 개발에 도움이 될 것입니다.
RNA 간섭 (RNAi)4,의 도래와 함께5 및 게놈 편집 도구 (예., CRISPR-Cas9, 아연 손가락 nucleases TALENs)6,7, 실험적으로 변경 가능한 되고있다는 게놈 넓은에 세포질 요인의 식을 확장 하 고 바이러스 복제에 이러한 변경의 영향. 실제로, 수많은 RNAi 및 편집-게놈 스크린 실시 되었습니다 바이러스-호스트 상호 작용8,,910, 의 새로운 측면을 발표 했다 무척 추 및 척추 호스트 셀 유형 11 , 12. 일반적으로 바이러스 기자, 반딧불 luciferase (루크) 또는 형광 성 단백질 등을 인코딩을 사용 하는이 화면 (예., GFP, DsRed), 양적 평가 판독으로 바이러스 성 유전자 발현의 편리한 수단을 제공 하는 바이러스 성 복제9,12에 대 한. 이 전략 중 홍보 또는 각각 증가 또는 감소에 의해 입증으로 바이러스 성 복제를 반대, 바이러스 성 기자 신호9,12호스트 요소를 식별 하는 연구를 수 있습니다. 그러나, 대부분의 경우에서 이러한 화면 실시 되어 있는 그들은 공부 되 고 있다 호스트 셀 형식에 잘 적응 하는 바이러스를 사용 하 여. 이 전략이 될 수 있지만 바이러스 성 병원 체 및 그들의 자연적인 호스트 간의 coevolutionary 관계를 이해 하기 위한 중요 한, 그것은 잠복 호스트 항 바이러스 요인에 그들의 사용에 관한 근본적인 문제를 제기지 않습니다. 이러한 경우 바이러스 기자에 있는 증진 최저는 되 찾고, RNAi 나 세포 요소는 일반적으로 바이러스 성 복제를 방해의 비활성화 신호. 첫째, 이면 바이러스가 이미 엄격 하 게 제어 조건 하에서 시험 되 고 호스트 셀에 복제할 수 화면 (즉, 배경 및 향상 된 바이러스 성 기자 신호 사이 구별 하는 기능)의 동적 범위 제한 될 수 있습니다. 둘째,이 문제는 바이러스는 주인 세포에 잘 적응 하 고 화면에 타겟이 되고있다 호스트 방어 통로 대항에서 효과적인 상황에 의해 더 합성 된다.
전통적인 바이러스-호스트 상호 작용 방법 심사에 관한 위의 우려로 인해 우리는 lepidopteran 곤충 세포에서 자연적으로 유산 arbovirus 감염을 악용 하는 바이러스-호스트 상호 작용을 공부에 대 한 새로운 패러다임을 개발 했다. 이 전략은 잘 공부 인간의 arbovirus, VSV, 집시 나 방 (L. dispar)13에서 파생 된 셀에 조산 감염을 겪 습 관측에서 파생 한다. VSV는 자연스럽 게 포유류 호스트, dipteran 곤충 (즉, 모래 파리)에 의해 전송 무척추동물의 넓은 범위를 감염 하기 위하여 실험적으로 표시 되었습니다 및 척추 호스트 모두에 셀 문화 그리고 vivo에서14. VSV의 11 kb 부정 감지 단일 가닥 RNA 게놈 각각 엔벌로프된 virion 구성 하는 단백질으로 번역 하는 5 개의 subgenomic mRNAs를 인코딩합니다. 그러나, VSV 역 유전자 시스템 인코딩 루크 또는 5 자연 VSV 유전자 제품15,,1617이외에 형광 단백질, 복제 유능한 긴장의 창조에 대 한 수 있다. 이 기자 단백질은 VSV virion에 통합 되지, 때문에 그들은 후 항목을 발생 하는 VSV 유전자 발현에 대 한 편리한 판독을 제공 합니다. VSV 긴장 GFP 또는 루크 인코딩을 사용 하 여, 우리는 이전 표시 VSV 유전자 발현은 LD652 셀의 항목에 따라 엄격 하 게 제한 VSV titers 72 시간 후 감염 (hpi)에 의해 증가 하지 않습니다. 반면, VSV와 포유류 poxvirus, vaccinia 바이러스 (VACV), LD652 세포의 coinfection VSV 유전자 발현에 titers 로그 증가이 시간 포인트 리드. VACV는 이른 유전자 발현, DNA 복제, 및 LD652 세포 감염에서 늦은 유전자 발현을 겪 습 하지만 VACV 복제 주기 때문에 불완전 한 virion morphogenesis18궁극적으로 실패. VACV의 큰 ~ 192 kb DNA 게놈 많은 호스트 면역 응답19의 억제를 통해 바이러스 성 복제를 촉진 immunomodulatory 속성을 표시 하는 > 200 단백질을 인코딩합니다. 따라서, 우리는 VSV 복제 VACV coinfection LD652 셀에서의 “구조”는 가능성이 VACV immunomodulators L. dispar 응답 VSV 복제를 제한 하는 일반적으로 저해 하 여 중재 하는 가설. 이 지원 호스트 RNA 중 합 효소 II 억제제 악티노마이신 D와 LD652 세포의 치료 또한 VSV 복제 LD652 세포에서 전사 종속 호스트 응답 VSV 복제 후 항목13블록 나타내는 구출.
위의 관찰 VSV 인코딩 기자 신호 (즉, 호스트를 억제 하는 그를 강화 하는 조건에 대 한 심사 때 자연스럽 게 제한적인 성격의 VSV 감염 LD652 셀 상대적으로 낮은 배경을 제공할 수 있습니다 제안 항 바이러스 방어)입니다. 여기, 우리는 조건 완화 VSV 제한 lepidopteran 세포에서 형광 또는 루크 기반 분석 화면을 사용 하기 위한 방법을 제공 합니다. 첫째, 우리는 VSV 제한 중 coinfection 실험 중 또는 후보 바이러스 성 요인의 소성 표현을 통해 휴식 virally 인코딩된 immunomodulatory 요소를 식별 하기 위해 이러한 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, 우리는 어떻게 우리가 다른 poxvirus 요인13의 부재에 VSV 복제 구조 immunomodulatory 요인의 새로운 가족으로 poxvirus 인코딩된 A51R 단백질을 식별 하기 위해 이러한 심사 기법을 사용을 보여 줍니다. 둘째, 우리는 RNAi 제한적인 VSV LD652 세포 감염에서 심사를 사용 하 여 직접 arbovirus 제한13에 관련 된 진 핵 호스트 요소를 식별 하는 방법을 보여 줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리는 VSV 복제 제한 lepidopteran 세포 배양에서 구출 하는 조건에 대 한 화면을 간단한 형광 및 발광 기반 분석 실험을 설명 했습니다. Lepidopteran 셀에 VSV의 조산 감염 VSV 유전자 발현에 대 한 시 금 때 우수한 신호 대 잡음 비율을 만듭니다. 예를 들어 단일 VSV 뤽 감염에서 lysates 감지 LU 신호 했다 ~ 1,000-fold 보다 높은 모의 감염 lysates 아직 이러한 신호만 72 h 시간 걸쳐 약 두 가지를 변경. VSV-루크?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G.는 텍사스 대학의 남서부 의료 센터의 부여 학자 프로그램에서 자금을 지원 했다. 저자는 마이클 휘 트 (테네시 대학 건강 과학 센터)와 숀 Whelan (하버드의과 대학) VSV DsRed 및 VSV 뤽의 조항에 대 한 감사. 또한 저자 게리 Luker (미시간 대학의과 대학) VACV-플로리다-GFP 긴장의 종류 선물 감사합니다.
Materials
| 6-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229106 | |
| 24-well tissue culture plates | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | C430167 | |
| Grace’s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth medium | 1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×) | Sigma | A5955 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| Serum Free Media (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| Cytosine arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25950CQC | |
| Reporter lysis buffer 5X | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| Mouse anti-FLAG antibody | Wako | 014-22383 | |
| Rabbit anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab21176 | |
| Mouse anti-actin antibody | Sigma | A2066 | |
| Mouse anti-VSV M | N/A | N/A | Dr. John Connor (Boston University) |
| Mouse anti-VACV I3L | N/A | N/A | Dr. David Evans (University of Alberta) |
| 8-well Chambered dish | Lab-Tek II | 155409 | |
| Cell viability dye | Thermo Fisher | C12881 | |
| FLUOstar microplate reader | BMG Labtech | FLUOstar | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| Image analysis software | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 ventilated centrifuge | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc Infrared Imaging System | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 cells | N/A | N/A | Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada) |
| BSC-40 cells | ATCC | CRL-2761 | |
| BHK cells | ATCC | CCL-10 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| BSC-1 cells | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro transcription and purification kit | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 |
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