मानवीय मंजूरी/SCID/IL2rγअशक्त (हू-एनएसजी) एचआईवी प्रतिकृति और विलंबता अध्ययन के लिए माउस मॉडल
Summary
इस प्रोटोकॉल विकिरण वातानुकूलित नवजात एनएसजी चूहों में मानव टेम स्टेम कोशिकाओं के intrahepatic इंजेक्शन के माध्यम से मानव चूहों (हू-एनएसजी) स्थापित करने के लिए एक विधि प्रदान करता है । हू-एनएसजी माउस एचआईवी संक्रमण और मिश्रित एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (गाड़ी) के लिए अतिसंवेदनशील है और एचआईवी प्रतिकृति और विलंबता जांच के लिए एक उपयुक्त pathophysiological मॉडल के रूप में कार्य करता है ।
Abstract
मानव विकृति, इम्यूनोलॉजी, और चिकित्सीय विकास में अनुसंधान के लिए नैतिक विनियमों और तकनीकी चुनौतियां उच्च मांग में छोटे पशु मॉडल रखा है । मनुष्य के लिए एक करीबी आनुवंशिक और व्यवहार समानता के साथ, माउस के रूप में छोटे जानवरों मानव रोग मॉडल, जिसके माध्यम से मानव के लक्षण और प्रतिक्रियाओं की तरह recapitulated जा सकता है के लिए अच्छे उम्मीदवार हैं । इसके अलावा, माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए विभिंन मांगों को समायोजित बदला जा सकता है । मंजूरी/SCID/IL2rγअशक्त (एनएसजी) माउस सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रतिरक्षा माउस उपभेदों में से एक है; यह मानव टेम स्टेम कोशिकाओं और/या मानव ऊतकों और एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बाद के विकास के साथ engraftment की अनुमति देता है । इस तरह के एचआईवी के रूप में मानव-विशिष्ट रोगों का पूर्वानुमान और pathophysiology को समझने में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर है और एक इलाज के लिए खोज सहायता । साथ ही, हम एक विकिरण वातानुकूलित नवजात एनएसजी माउस में टेम स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन द्वारा एक मानव निर्मित एनएसजी माउस मॉडल (हू-एनएसजी) पैदा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । हू-एनएसजी माउस मॉडल प्रत्यारोपण मानव स्टेम सेल और एचआईवी-1 वायरल संक्रमण के लिए संवेदनशीलता का बहु वंश विकास से पता चलता है । यह भी मिश्रित एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (गाड़ी) के जवाब में प्रमुख जैविक विशेषताओं recapitulates ।
Introduction
क्योंकि मानव रोगों के लिए उपयुक्त पशु मॉडल की स्थापना एक इलाज खोजने के लिए महत्वपूर्ण है, उपयुक्त जानवरों के मॉडल लंबे समय से पीछा किया गया है और सुधार हुआ है । प्रतिरक्षा murine मॉडल के कई उपभेदों विकसित किया गया है कि मानव कोशिकाओं और/या ऊतकों और मानव कार्य1,2के बाद के निष्पादन के engraftment की अनुमति है । मानव विशेष रोगों की जांच के लिए इस तरह के मानवतावादी माउस मॉडल महत्वपूर्ण है3,4,5।
मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के साथ संक्रमण से उत्पन्न प्रतिरक्षा कमी सिंड्रोम (एड्स) का अधिग्रहण एक उदाहरण है । मानवतावादी माउस मॉडल की स्थापना करने से पहले, गैर-मानव रहनुमाओं को एचआईवी/एड्स पूर्व नैदानिक पशु अध्ययनों की नैतिक और तकनीकी सीमाएं3। हालांकि, इस तरह के पशुओं के लिए विशेष देखभाल के लिए उच्च व्यय और आवश्यकताओं एचआईवी में बाधा/ एचआईवी मुख्यतः मानव CD4 + टी कोशिकाओं को संक्रमित और अंय मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रभाव जैसे बी-कोशिकाओं, मैक्रोफेज, और वृक्ष कोशिकाओं6; इसलिए, छोटे पशु कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ प्रत्यारोपण मॉडल उच्च मांग में हैं ।
एक सफलता १९८८ में आया था, जब एक Prkdcscid उत्परिवर्तन के साथ CB17-scid चूहों विकसित और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली1के सफल engraftment दिखाया गया । Prkdcscid दोषपूर्ण टी में उत्परिवर्तन परिणाम और बी सेल कार्य और चूहों में एक ablated अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, जिससे मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs), टेम स्टेम कोशिकाओं (HSCs) के engraftment को सक्षम करने, और भ्रूण टेम ऊतकों7,8. फिर भी, engraftment के निम्न स्तर अक्सर इस मॉडल में मनाया जाता है; संभावित कारण हैं 1) अवशिष्ट जन्मजात प्रतिरक्षा गतिविधि प्राकृतिक हत्यारा (NK) के माध्यम संग्राहक-कोशिकाओं और 2) देर से चरण विकास माउस के टी-और बी-कोशिकाओं (leakiness)5. गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (मंजूरी) के बाद के विकास-scid माउस मॉडल नाटकीय नीचे हासिल NK-सेल गतिविधि के विनियमन; इस प्रकार, यह एक उच्च स्तर और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के घटक9के अधिक टिकाऊ engraftment का समर्थन करने में सक्षम है । आगे को दबाने या सहज प्रतिरक्षा के विकास में बाधा, माउस मॉडल (मंजूरी) में interleukin-2 रिसेप्टर γ-चेन (Il2rg) का असर जनचेतना या कुल नॉकआउट-scid पृष्ठभूमि की स्थापना की गई । Il2rg, भी आम cytokine रिसेप्टर γ-श्रृंखला के रूप में जाना जाता है, विभिन्न cytokine रिसेप्टर्स की एक अनिवार्य घटक है10,11,12,13. मंजूरी जैसे संवेदनहीन । तटरक्षक-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (एनएसजी) और NODShi.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug (नोग) वर्तमान में माउस के मजबूत व्यवधान cytokine संकेतन और पृथक-सेल विकास के पूर्ण NK, में अनुकूली उन्मुक्ति की गंभीर हानि के अलावा14,15,16.
तीन मानवतावादी माउस मॉडल एक scid उत्परिवर्तन और Il2rg नॉकआउट असर अक्सर एचआईवी/एड्स अनुसंधान में कार्यरत हैं: बीएलटी (अस्थि मज्जा/जिगर/थाइमस) मॉडल, PBL (परिधीय रक्त ल्युकोसैट) मॉडल, और SRC (scid पुनः आबाद सेल) मॉडल 3. बीएलटी मॉडल मानव भ्रूण जिगर और थाइमस भ्रूण जिगर HSCs3,17,18के नसों में इंजेक्शन के साथ साथ माउस गुर्दे कैप्सूल के तहत सर्जिकल प्रत्यारोपण के माध्यम से बनाया गया है । बीएलटी माउस मॉडल उच्च engraftment प्रभावकारिता प्रदान करता है, सभी वंश में मानव टेम कोशिकाओं के विकास, और एक मजबूत मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना; इसके अतिरिक्त, टी कोशिकाओं को एक मानव ऑटोलॉगस थाइमस और प्रदर्शन एचएलए-प्रतिबंधित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं4,5,17,19में शिक्षित कर रहे हैं । हालांकि, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता बीएलटी मॉडल की प्रमुख खामी बनी हुई है । PBL माउस मॉडल मानव परिधीय लसीकावत् कोशिकाओं के साथ नसों में इंजेक्शन द्वारा स्थापित किया गया है । PBL मॉडल सुविधा और पैदावार सफल टी सेल engraftment प्रदान करता है, लेकिन अपने आवेदन अपर्याप्त बी सेल और माइलॉयड कोशिका engraftment, कम engraftment समग्र स्तर के कारण सीमित है, और गंभीर भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GVHD) 3 की शुरुआत ,20. SRC माउस मॉडल मानव HSCs के इंजेक्शन के माध्यम से नवजात या युवा वयस्क SCID चूहों में स्थापित किया गया है । यह 25% से ऊपर औसत engraftment दक्षता दर्शाती है (परिधीय रक्त CD45 प्रतिशत के रूप में मूल्यांकन) और इंजेक्शन HSCs के कई वंश विकास और एक सहज मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के विस्तार का समर्थन करता है । हालांकि, SRC मॉडल की सीमा है कि टी-सेल प्रतिक्रिया माउस H2-प्रतिबंधित के बजाय मानव एचएलए-प्रतिबंधित14,21है ।
SRC माउस मॉडल नैदानिक एचआईवी के लिए एक सतही और विश्वसनीय मॉडल माना जाता है/एड्स छोटे जानवर अध्ययन, उदाहरण एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और सफल टेम विकास के अनुरूप engraftment द्वारा । हम पहले एक एनएसजी हू-SRC-SCID (हू-एनएसजी) माउस मॉडल की स्थापना की सूचना और एचआईवी प्रतिकृति और विलंबता अध्ययन में अपने आवेदन वर्णित22,23,24। यह हू-एनएसजी माउस मॉडल अस्थि मज्जा होमिंग के उच्च स्तर को दर्शाती है, एचआईवी संक्रमण के लिए संवेदनशीलता, और एचआईवी संक्रमण और रोगजनन के recapitulation । इसके अतिरिक्त, हू-एनएसजी माउस मॉडल के लिए उचित जवाब मिश्रित एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (गाड़ी) और recapitulates प्लाज्मा गाड़ी वापसी पर वायरल खुशहाली लौटने लगी, एक एचआईवी विलंबता जलाशय की स्थापना की पुष्टि25,26 ,27. इस एचआईवी विलंबता जलाशय और प्रतिकृति सक्षम एचआईवी वायरस के उत्पादन से पुष्टि की है पूर्व मानव आराम CD4 से प्रेरित vivo + टी कोशिकाओं संक्रमित और गाड़ी से अलग-इलाज किया हू-एनएसजी चूहों ।
साथ ही, हम नवजात एनएसजी चूहों से हू-एनएसजी माउस मॉडल की स्थापना के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें विलंबता विकास के लिए एचआईवी संक्रमण और गाड़ी के उपचार से संबंधित प्रक्रियाएं शामिल हैं । हम इस प्रोटोकॉल एचआईवी वायरोलॉजी, विलंबता के बारे में एचआईवी पशु अध्ययन में दृष्टिकोण का एक नया सेट की पेशकश करने की उंमीद है, और उपचार ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रतिरक्षा चूहों मानव कोशिकाओं के साथ engrafted/मानव की तरह शारीरिक विशेषताओं और विकृति के लिए एक जबरदस्त मूल्य रहे हैं, pathophysiology, और इम्यूनोलॉजी मानव विशेष रोगों के विषय में अध्ययन. प्रतिरक्षा चूहों के कई उपभ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था [अनुदान संख्या R01AI29329, R01AI42552 और R01HL07470 के लिए J.J.R.] और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर इंस्टीट्यूट [अनुदान संख्या P30CA033572 को आशा एकीकृत जीनोमिक्स के शहर का समर्थन , विश्लेषणात्मक औषध, और विश्लेषणात्मक Cytometry कोर] । निंनलिखित एजेंट NIH एड्स अनुसंधान और संदर्भ एजेंट कार्यक्रम, एड्स, NIAID, NIH: एचआईवी बाल वायरस के विभाजन के माध्यम से प्राप्त किया गया था ।
Materials
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
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