أنسنة إيماءة/نظام/IL2rγفارغة الماوس (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) نموذج للنسخ المتماثل من فيروس نقص المناعة البشرية والدراسات الكمون
Summary
هذا البروتوكول يوفر طريقة لإنشاء أنسنة الفئران (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) عن طريق حقن أحياناً من الخلايا الجذعية المكونة للدم البشري في الإشعاع مكيفة الولدان الفئران مجموعة موردي المواد النووية. الماوس هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية هو عرضه للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية والعلاج المضاد للفيروسات الرجعية اندماجي (عربة) ويخدم كنموذج مناسب الفيزيولوجية المرضية للتحقيقات النسخ المتماثل وزمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية.
Abstract
القواعد الأخلاقية والتحديات التقنية للبحوث في علم الأمراض البشرية وعلم المناعة والتنمية العلاجية قد وضعت نماذج حيوانية صغيرة في ارتفاع الطلب. مع تشابه شديد الجينية والسلوكية للبشر، هي الحيوانات الصغيرة مثل الماوس مرشحا جيدا لنماذج الأمراض البشرية، يمكن من خلالها لخص أعراض شبيهة بالإنسان والردود. علاوة على ذلك، يمكن تغيير الخلفية الوراثية الماوس لاستيعاب المطالب المتنوعة. إيماءة/نظام/IL2rγ الماوسفارغة (مجموعة موردي المواد النووية) واحدة من سلالات الماوس المناعة الأكثر استخداماً؛ فإنه يسمح انجرافتمينت بالخلايا الجذعية المكونة للدم البشري و/أو الأنسجة البشرية والتطور اللاحق لنظام المناعة البشرية الفنية. وهذا معلما حاسما في فهم التشخيص والفيزيولوجيا المرضية للإنسان-خاصة بأمراض مثل فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز، ومساعدة في البحث عن علاج. هنا، نحن تقرير بروتوكول مفصل لتوليد نموذج ماوس أنسنة مجموعة موردي المواد النووية (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) بزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم في ماوس مجموعة موردي المواد النووية الولدان مكيفة الإشعاع. يظهر نموذج الفأر هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية تطوير نسب متعددة لزرع الخلايا الجذعية البشرية والقابلية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الفيروسية. كما أنه يلخص الخصائص البيولوجية الرئيسية استجابة للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية اندماجي (عربة).
Introduction
لإنشاء نماذج حيوانية مناسبة للأمراض التي تصيب الإنسان هو المفتاح لإيجاد علاج، نماذج الحيوانات المناسبة منذ فترة طويلة تم متابعتها وتتحسن مع مرور الوقت. وقد وضعت سلالات متعددة من نماذج مورين المناعة التي تسمح انجرافتمينت من الخلايا البشرية و/أو الأنسجة واللاحقة تنفيذ مهام أنسنة1،2. مثل هذه النماذج الماوس أنسنة حاسمة بالنسبة للتحقيقات المتعلقة بالأمراض الخاصة بالإنسان3،،من45.
متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) الناتجة عن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) مثال واحد. قبل إنشاء نماذج الماوس أنسنة، تقتصر القيود الأخلاقية والتقنية فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز السريرية دراسات أجريت على الحيوانات أن المقدمات غير البشرية3. ومع ذلك، ارتفاع النفقات والاحتياجات للرعاية المتخصصة لمثل هذه الحيوانات تعيق الدراسات فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز في الإعدادات الأكاديمية النموذجية. فيروس نقص المناعة البشرية أساسا يصيب البشرية CD4 + T-الخلايا ويؤثر التنمية والاستجابات المناعية الخلايا المناعية البشرية الأخرى مثل الخلايا البائية، الضامة، والخلايا الجذعية6؛ ولذلك، نماذج حيوانية صغيرة زرعها مع نظم المناعة البشرية الفنية في ارتفاع الطلب.
وجاءت انطلاقة في عام 1988، عندما وضعت الفئران CB17-مشمولان بطفرة بركدكإخضاعها وأظهرت engraftment الناجح ل نظام المناعة البشرية1. نتائج الطفرات بركدكمشمولان في مهام خلية تي وب المعيبة ونظام المناعة تكيفية أبلاتيد في الفئران، مما يمكن انجرافتمينت من الأجهزة الطرفية البشرية الدم الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، و الأنسجة المكونة للدم الجنين7،8. ومع ذلك، كثيرا ما لوحظت مستويات منخفضة من انجرافتمينت في هذا النموذج؛ الأسباب المحتملة 1) المتبقية نشاط المناعة الفطرية التضمين عبر القاتل الطبيعية (ناغورني كاراباخ)-الخلايا و 2) تطوير المرحلة المتأخرة من الماوس وب-الخلايا التائية (يجتازها)5. التطور اللاحق لمرضى السكري غير البدناء (NOD)-مشمولان الماوس نموذج تحقق أسفل درامية-تنظيم نشاط ناغورني كاراباخ-الخلية؛ وهكذا، أنها قادرة على دعم مستوى أعلى وأكثر انجرافتمينت المستدام ل مكونات الجهاز المناعي البشري9. مواصلة قمع أو إعاقة التنمية للحصانة الفطرية، نماذج الماوس واضعة الاقتطاع أو خروج المغلوب مجموع interleukin-2 مستقبلات γ-سلسلة (Il2rg) في (الموافقة)–تم إنشاء خلفيةإخضاعها . Il2rg، γ سيتوكين-مستقبلات تعرف أيضا باسم المشترك-سلسلة، عنصر لا غنى عنه لمختلف سيتوكين مستقبلات10،11،،من1213. سلالات مثل انحناء. Cg-بركدكإخضاعهاIl2rgtm1Wji (مجموعة موردي المواد النووية) و NODShi.Cg-بركدكإخضاعهاIl2rgtm1Sug (وتد) يقدم قوي تعطيل الماوس سيتوكين إشارات والاجتثاث الكامل لوضع ناغورني كاراباخ-الخلية، في بالإضافة إلى إعاقة شديدة لمناعة التكيفية14،،من1516.
غالباً ما يلجأ ثلاثة نماذج الماوس أنسنة آخذا إخضاعها الطفرة و Il2rg بالضربة القاضية في أبحاث فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز: نموذج يستأجره (نخاع العظام/الكبد/الغدة الصعترية)، ونموذج PBL (من الكريات البيض الدموية الطرفية)، ونموذج SRC (الخلية إعادة إسكانها يكونوا مشمولان) 3. BLT نموذج يتم إنشاؤها عن طريق العمليات الجراحية زرع كبد الجنين البشري والغدة الصعترية تحت الكبسولة الكلي الماوس مصحوبا بالحقن الوريدي للجنين الكبد هسكس3،،من1718. يوفر الطراز الماوس يستأجره engraftment عالية الفعالية، التنمية البشرية الخلايا المكونة للدم في جميع الأنساب، وإنشاء نظام المناعة القوى البشرية؛ بالإضافة إلى ذلك، الخلايا التائية المتعلمات الغدة الصعترية ذاتي بشرية ويحمل المقيدة-هلا الاستجابات المناعية4،5،،من1719. ومع ذلك، يبقى الحاجة إلى العمليات الجراحية العيب الرئيسي من طراز BLT. هو إنشاء نموذج الماوس PBL عن طريق الحقن الوريدي مع الخلايا اللمفاوية الطرفية البشرية. نموذج PBL يوفر الراحة وغلة ناجحة تي خلية انجرافتمينت، ولكن تطبيقه محدودة بسبب غير كافية ب-الخلية و engraftment خلية النقوي، مستويات engraftment منخفضة عموما، وظهور أمراض شديدة في الفساد – مقابل – المضيف (GVHD)3 ،20. يتم تأسيس نموذج الماوس SRC من خلال ضخ هسكس البشرية في حديثي الولادة أو صغار البالغين مشمولان الفئران. معارض انجرافتمينت متوسط كفاءة أعلى من 25% (اعتبرت الدم المحيطي النسبة المئوية CD45)، ويدعم تطوير متعددة-النسب هسكس حقن ووضع نظام المناعة البشرية الفطرية. ومع ذلك، هو الحد الطراز SRC أن استجابة خلايا T الفأر المقيدة-H2 بدلاً من البشرية المقيدة-هلا14،21.
يعتبر الطراز الماوس SRC نموذج سهلة وموثوق بها السريري فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز الصغيرة الدراسات الحيوانية، يتجلى engraftment يتسق نظام المناعة البشري والتنمية الناجحة المكونة للدم. ونحن سابقا ذكرت إنشاء نموذج ماوس “مجموعة موردي المواد النووية” هو جين تاو SRC إخضاعها (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) ووصف تطبيقه في النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية والكمون الدراسات22،،من2324. يسلك هذا الطراز الماوس هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية مستويات عالية من صاروخ موجه نخاع العظام، والقابلية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، وخلاصة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية والمرضية. بالإضافة إلى ذلك، يستجيب على نحو ملائم للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية اندماجي (عربة) نموذج الفأر هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية ويجمل البلازما الارتداد الفيروسي عند سحب عربة، يؤكد إنشاء فيروس نقص المناعة البشرية الكمون الخزان25،26 ،27. هذا الخزان زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية كذلك بأدلة إنتاج فيروس النسخ المتماثل المختصة الفيروسات السابقين فيفو الناجمة عن الإنسان يستريح CD4 + تي الخلايا المعزولة من الفئران المصابة والمعالجة بعربة هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية.
هنا، يمكننا وصف البروتوكول مفصلاً لإنشاء نموذج الفأر هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية من المواليد الفئران مجموعة موردي المواد النووية، بما في ذلك الإجراءات المتصلة بفيروس نقص المناعة البشرية العلاج العدوى وعربة للتنمية الكمون. ونحن نتوقع هذا البروتوكول لتقديم مجموعة جديدة من النهج في الدراسات الحيوانية فيروس نقص المناعة البشرية فيما يتعلق بفيروس نقص المناعة البشرية الفيروسات والكمون، والعلاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفئران المناعة انجرافتيد مع خلايا/الأنسجة البشرية موجودة الخصائص الفسيولوجية شبيهة بالإنسان وقيمة هائلة لدراسات علم الأمراض والفيزيولوجيا المرضية، وعلم المناعة بشأن الأمراض الخاصة بالإنسان. بين عدة سلالات من الفئران المناعة، الموافقة. Cg-بركدكإخضاعهاIl2rgtm1Wji النموذجي …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمه معاهد الصحة الوطنية [منح الأرقام R01AI29329 و R01AI42552 و R01HL07470 J.J.R.] والمعهد الوطني للسرطان من “المعاهد الوطنية للصحة” [المنحة رقم P30CA033572 لدعم المدينة “علم الجينوم التكاملية في الأمل” ، الصيدلة التحليلية، والنوى الخلوي تحليلية]. وحصل الكاشف التالية عن طريق المعهد الوطني لبحوث الإيدز المعاهد الوطنية للصحة ومرجع برنامج كاشف، شعبة من الإيدز، نييد، الصحة: فيروس “ال فيروس نقص المناعة البشرية”.
Materials
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
References
- Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
- Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
- McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
- Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
- King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
- Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
- Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
- Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
- Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
- Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
- Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
- Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
- van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
- Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
- Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
- Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
- Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
- Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
- Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).
