JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Immunologie et infection

Humaniseret SCID-NOD-IL2rγnull (hu-NSG) mus Model for HIV replikation og Latency undersøgelser

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Denne protokol indeholder en metode til at etablere humaniseret mus (hu-NSG) via intrahepatisk injektion af menneskelige hæmatopoietisk stamceller i stråling-aircondition neonatal NSG mus. Hu-NSG musen er modtagelige for HIV-infektion og kombinatorisk antiretroviral behandling (vogn) og tjener som en passende patofysiologiske model for HIV replikation og latency undersøgelser.

Abstract

Etiske regler og tekniske udfordringer for forskning i menneskelige patologi, immunologi og terapeutisk udvikling har lagt små dyremodeller i høj efterspørgsel. Med en tæt genetiske og adfærdsmæssige lighed med mennesker er små dyr som musen gode kandidater til menneskers sygdomsmodeller, hvorigennem menneske-lignende symptomer og svar kan blive sammenfattet. Yderligere, mus genetiske baggrund kan blive ændret for at imødekomme forskellige krav. SCID-NOD-IL2rγnull (NSG) mus er en af de mest udbredte immunkompromitterede mus stammer; Det giver mulighed for engraftment med menneskelige hæmatopoietisk stamceller og/eller humane væv og den senere udvikling af en funktionel menneskelige immunsystem. Dette er en afgørende milepæl i forståelsen af de prognose og Patofysiologi af menneske-specifikke sygdomme som HIV/AIDS og medvirken søgen efter en kur. Heri, rapporterer vi en detaljeret protokol til at generere en humaniseret NSG musemodel (hu-NSG) af hæmatopoietisk stamcelletransplantation til en stråling-aircondition neonatal NSG mus. Hu-NSG musen model viser multi lineage udvikling af transplanterede menneskelige stamceller og modtagelighed for HIV-1 viral infektion. Det indeholder også vigtige biologiske karakteristika som svar på kombinatorisk antiretroviral behandling (vogn).

Introduction

Fordi etablering af passende dyremodeller for humane sygdomme er nøglen til at finde en kur, har passende dyr modeller længe været forfulgt og forbedret over tid. Blevet udviklet flere stammer af immunkompromitterede murine modeller, der tillader engraftment af menneskelige celler og/eller væv og den efterfølgende udførelse af humaniseret funktioner1,2. Sådanne humaniseret musemodeller er kritisk for undersøgelser af menneske-specifikt sygdomme3,4,5.

Erhvervet immundefekt syndrom (AIDS) som følge af infektion med human immundefekt virus (HIV) er et eksempel. Inden fastsættelsen af humaniseret musemodeller begrænset etiske og tekniske begrænsninger HIV/AIDS prækliniske dyreforsøg til ikke-menneskelige primater3. Dog hæmme høje udgifter og krav til specialiseret pleje for sådanne animal HIV/AIDS undersøgelser i typiske akademiske indstillinger. HIV primært inficerer menneskelige CD4 + T-celler og dens indvirkning på udvikling og immunrespons af andre menneskers immunceller som B-celler, makrofager og dendritiske celler6; Derfor, lille dyremodeller transplanteret med funktionelle menneskers immunforsvar er i høj efterspørgsel.

Et gennembrud kom i 1988, da CB17 –scid mus med en Prkdcscid mutation blev udviklet og viste vellykket engraftment af det menneskelige immunsystem1. Prkdcscid mutation resultater i defekte T – og B-celle funktioner og en ablated adaptive immunsystem i mus, hvorved engraftment af humant perifert blod mononukleære celler (PBMC), hæmatopoietisk stamceller (HSCs), og føtal hæmatopoietisk væv7,8. Ikke desto mindre, lave niveauer af engraftment er ofte observeret i denne model; mulige årsager er 1) resterende medfødte immun aktivitet moduleret via natural killer (NK)-celler og 2) den sene udvikling af musen T – og B-celler (leakiness)5. Den senere udvikling af den ikke-overvægtige diabetikere (Nik)-scid musemodel opnået dramatisk ned-regulering af NK-celle aktivitet; Det er således kunne understøtte et højere niveau og mere bæredygtig engraftment menneskelige immunsystem komponenter9. Til yderligere undertrykke eller hindre udvikling af medfødt immunitet, musemodeller forsynet med trunkering eller samlede knockout af interleukin-2 receptor γ-kæden (Il2rg) i (NIKKER) –scid baggrund blev etableret. Il2rg, også kendt som fælles cytokin-receptor γ-kæde, er en uundværlig bestanddel af forskellige cytokin receptorer10,11,12,13. Stammer som hilsen. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) og NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) fremlægge robust afbrydelse af musen cytokin signalering og komplet ablation af NK-celle udvikling, tilføjelse til alvorlig forringelse af adaptive immunitet14,15,16.

Tre humaniseret musemodeller forsynet med en scid mutation og Il2rg knockout er ofte ansat i HIV/AIDS-forskning: BLT (knoglemarv/leveren/Thymus) model, PBL (perifere blod leukocyt) model og SRC (SCID genopretning celle) model 3. the BLT model er skabt via kirurgiske transplantation af menneskelige føtal lever og thymus under musen nyre kapsel ledsaget med intravenøs injektion af føtal lever HSCs3,17,18. BLT musen model tilbyder høj engraftment effektivitet, udvikling af menneskelige hæmatopoietisk celler i alle slægter, og etablering af en stærk menneskelige immunsystem; Derudover T-celler er uddannet i en menneskelig autolog thymus og udstille HLA-begrænset immunrespons4,5,17,19. Kravet om kirurgiske procedurer er dog den store ulempe ved modellen BLT. PBL musen model er etableret ved intravenøs injektion med menneskelige perifere lymfoide celler. PBL-modellen byder på bekvemmelighed og giver vellykket T-celle engraftment, men dens anvendelse er begrænset på grund af utilstrækkelig B-celle og myeloide celler engraftment, lav engraftment niveauer samlede og udbrud af alvorlige graft – versus – host sygdom (GVHD)3 ,20. SRC mus modellen er etableret gennem indsprøjtning af menneskelige HSCs i nyfødte eller unge voksne SCID mus. Det udstiller gennemsnitlige engraftment effektivitet over 25% (vurderet som perifert blod CD45 procent) og understøtter flere-lineage udviklingen af injicerede HSCs og udarbejdelse af en medfødte menneskelige immunsystem. Begrænsning af SRC model er dog, at T-celle respons er mus, H2-begrænset i stedet for menneskelige HLA-begrænset14,21.

SRC musen model betragtes som en letkøbt og pålidelig model for prækliniske små dyr undersøgelser i HIV/AIDS, eksemplificeret ved den konsekvente engraftment menneskelige immunsystem og vellykket hæmatopoietisk udvikling. Vi tidligere rapporteret etableringen af en NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) musemodel og beskrevet sin ansøgning i HIV replikation og latency undersøgelser22,23,24. Denne hu-NSG musemodel udstiller høje niveauer af knoglemarven homing, modtagelighed for HIV-smitte, og sammenfatning af HIV-infektion og patogenese. Derudover hu-NSG musemodel reagerer behørigt på kombinatorisk antiretroviral behandling (vogn) og sammenfatter plasma viral rebound ved vogn udbetaling, bekræfter oprettelsen af en HIV latency reservoir25,26 ,27. Denne HIV latency reservoir er yderligere dokumenteret ved produktion af replikationskompetente HIV virus ex vivo induceret af menneskelige hvilende CD4 + T-celler isoleret fra inficerede og vogn-behandlede hu-NSG mus.

Heri, beskriver vi detaljerede protokollen for etableringen af hu-NSG musen model fra neonatal NSG mus, herunder procedurer i forbindelse med HIV-infektion og vogn behandling for ventetid udvikling. Vi forventer, at denne protokol for at kunne tilbyde et nyt sæt af tilgange i HIV dyreforsøg vedrørende HIV virologi, ventetid og behandling.

Protocol

Alle dyrs pleje og procedurer er blevet udført efter protokoller gennemgået og godkendt af byen af håb institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) afholdt af hovedinvestigator i denne undersøgelse (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Menneskelige føtal levervæv blev indhentet fra Advanced Bioscience ressourcer (Alameda, CA), en nonprofit organisation, i overensstemmelse med føderale og statslige regulativer. Leverandøren har sin egen institutionelle Review Board (IRB) og er kompatibel med menneske beskyttelseskr…

Representative Results

Flow flowcytometri analyse udføres ofte for at validere renheden af isolerede HSCs, evaluere engraftment niveauer, profil immunrespons virusinfektion, og undersøgelsen vogn effektivitet. En typisk antistof panel indeholder 4-6 individuelle fluorescently mærket antistoffer; en flow Flowcytometret med flere lasere og et bredt udvalg af filtre er således afgørende for at opnå nøjagtige resultater. For indledende engraftment …

Discussion

Immunkompromitterede mus aflægger med menneskelige celler/væv præsentere menneskelignende fysiologiske kendetegn og er en enorm værdi for patologi, Patofysiologi og Immunologi undersøgelser vedrørende human-specifikke sygdomme. Blandt flere stammer af immunkompromitterede mus, NIKKE. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) model er den mest immundefekte på grund af sin mangel på både medfødte og adaptive immunitet samt ablated mus-specifikke cytokin signalering3<su…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [tilskud numre, R01AI29329, R01AI42552 og R01HL07470 til J.J.R.] og National Cancer Institute af National Institutes of Health [tilskud antal P30CA033572 til støtte for byen af håb Integrativ genomforskning Analytiske farmakologi og analytiske flowcytometri kerner]. De følgende reagens blev opnået gennem NIH aidsforskning og Reference reagens Program, Division af AIDS, NIAID, NIH: HIV BaL virus.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Tags

Hu-NSG Mouse ModelHIV ReplicationHIV LatencyNon-invasiveHuman Stem CellsCD34+ HSCsNOD/SCID/IL2rγnull MiceCARTHIV InfectionEngraftment ValidationFlow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image