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Immunologie et infection

(Hu-NSG) souris humanisée NOD/SCID/IL2rγnull modèle d’études de latence et de réplication du VIH

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Ce protocole fournit une méthode pour établir des souris humanisées (hu-NSG) via intrahépatique injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à des souris NSG néonatales conditionné par rayonnement. La souris de l’hu-NSG est sensible à l’infection par le VIH et combinatoire antirétrovirales (cART) et sert de modèle physiopathologique adapté pour les enquêtes de réplication et latence du VIH.

Abstract

Règlements éthiques et les défis techniques de recherche en pathologie humaine, immunologie et développement thérapeutique ont mis des petits modèles animaux en forte demande. Avec une étroite ressemblance génétique et comportementale pour les humains, petits animaux tels que la souris sont de bons candidats pour les modèles de maladies humaines, à travers lequel les réponses et l’homme-comme des symptômes peuvent être récapitulées. En outre, le bagage génétique de la souris peut être modifié pour tenir compte des demandes diverses. La sourisnull (NSG) de NOD/SCID/IL2rγ est une des souches de souris immunodéprimées plus largement utilisé ; Il permet la greffe avec des cellules souches hématopoïétiques humaines et/ou des tissus humains et le développement ultérieur du système immunitaire humain fonctionnel. Il s’agit d’un jalon essentiel dans la compréhension le pronostic et la physiopathologie des maladies humaines spécifiques telles que le VIH/sida et d’aider à la recherche d’un remède. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant de générer un modèle de souris humanisé NSG (hu-NSG) par transplantation de cellules souches hématopoïétiques dans une souris NSG néonatale conditionné par rayonnement. Le modèle murin de hu-NSG montre le développement de lignées multiples des cellules souches humaines transplantées et de susceptibilité à l’infection virale du VIH-1. Il récapitule aussi des caractéristiques biologiques clés en réponse à un traitement antirétroviral combinatoire (cART).

Introduction

Parce que l’établissement approprié des modèles animaux de maladies humaines est essentielle pour trouver un remède, modèles animaux appropriés ont été longtemps poursuivis et améliorés au fil du temps. Plusieurs souches de modèles murins immunodéprimés ont été développés qui permettent la prise de la greffe de tissus et/ou de cellules humaines et de l’exécution ultérieure des fonctions humanisé1,2. Ces modèles de souris humanisée sont critiques pour les enquêtes sur les maladies humaines spécifiques3,4,5.

Syndrome d’immunodéficience acquise (sida) résultant de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un exemple. Avant la création de modèles murins humanisés, des limites éthiques et techniques confinée études animales précliniques de VIH/sida aux primates non humains3. Toutefois, les dépenses élevées et les exigences pour des soins spécialisés pour tel animal gênent études de VIH/sida dans les milieux universitaires typiques. Principalement, le VIH infecte les cellules humaines CD4 + T et impact sur le développement et les réactions immunitaires des autres cellules immunitaires humaines telles que les lymphocytes B, les macrophages et les cellules dendritiques6; C’est pourquoi, petits modèles animaux transplantés ayant un système immunitaire humain fonctionnel sont en forte demande.

Une percée est venue en 1988, quand CB17 –scid souris présentant une mutation Prkdcscid ont été conçus et ont montré une greffe réussie du système immunitaire humain1. Les résultats de mutation Prkdcscid dans les fonctions de cellules B et T défectueux et une ablation du système immunitaire adaptatif chez la souris, permettant ainsi la prise de greffe des périphériques humains de sang cellules mononucléaires (PBMC), les cellules souches hématopoïétiques (CSH), et les tissus hématopoïétiques foetaux7,8. Néanmoins, les faibles niveaux de prise de greffe sont fréquemment observées dans ce modèle ; les causes possibles sont 1) résiduelle activité du système immunitaire innée modulée par l’intermédiaire de tueuses naturelles (NK)-cellules et 2) le dernier stade de développement des souris (perméabilité) de lymphocytes T et B5. Le développement ultérieur de la non obèses diabétiques (Adi)-modèle de sourisscid atteint la régulation à la baisse spectaculaire de l’activité des cellules NK ; ainsi, il est capable de soutenir un niveau plus élevé et plus greffe durable du système immunitaire humain composants9. En plus d’autres suppriment ou entravent le développement de l’immunité innée, portant le total opercule de l’interleukine-2 récepteurs-chaîne γ (Il2rg) ou de troncature dans la (NOD) des modèles de souris –scid arrière-plan ont été établis. Il2rg, également connu sous le nom commun cytokine-receptor γ-chaîne, est un élément indispensable de diverses cytokines récepteurs10,11,12,13. Souches comme clin de œil. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) et NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) présentent des perturbations robuste de signalisation des cytokines de souris et une ablation complète du développement des cellules NK, dans Ajout d’une insuffisance sévère de l’immunité adaptative14,15,16.

Trois modèles de souris humanisée portant un scid , mutation et Il2rg knock-out sont fréquemment employés dans la recherche sur le VIH/sida : le modèle de BLT (moelle osseuse/foie/Thymus), le modèle PBL (leucocytes périphériques de sang) et le modèle SRC (cellule de repeuplement de SCID) 3. modèle le BLT est créé via transplantation chirurgicale du foie foetal humain et le thymus sous la capsule rénale de souris accompagné d’une injection intraveineuse de foetus foie autorenouveler3,17,18. Le modèle de souris BLT offre une efficacité élevée de greffe, développement de cellules hématopoïétiques humaines dans toutes les lignées et mise en place d’un système immunitaire fort ; en outre, les lymphocytes T sont instruits dans un thymus autologue humain et pièce restriction HLA des réponses immunitaires4,5,17,19. Toutefois, l’obligation pour les procédures chirurgicales reste l’inconvénient majeur du modèle BLT. Le modèle de souris PBL est établi par une injection intraveineuse avec des cellules lymphoïdes périphériques humaines. Le modèle PBL offre commodité et rendements greffe réussie de lymphocytes, mais son application est limitée en raison insuffisante de B-cellule et greffe de cellules myéloïdes, greffe faible niveaux globales et l’apparition de sévère greffon – versus – host disease (GVHD)3 ,,20. Le modèle de souris SRC s’établit par l’injection de csh humaine dans nouveau-né ou un jeunes adultes souris SCID. Il montre efficacité greffe moyen supérieur à 25 % (évalué comme sang périphérique CD45 pourcentage) et prend en charge le développement de multiple-lignée de csh injectée et l’élaboration d’un système immunitaire inné. Toutefois, la limitation du modèle SRC est que la réponse des lymphocytes est souris H2 restreints au lieu de restriction HLA humain14,21.

Le modèle de souris SRC est considéré comme un modèle fiable et facile pour le VIH/sida petits animaux des études précliniques, illustrée par la prise de greffe cohérente d’un système immunitaire et hématopoïétique mise au point. Précédemment, nous avons signalé la mise en place d’un modèle de souris de NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) et décrit son application dans la réplication du VIH et de la latence des études22,23,24. Ce modèle de souris de hu-NSG présente des niveaux élevés de domiciliation de la moelle osseuse, la susceptibilité à l’infection par le VIH et la récapitulation de l’infection par le VIH et la pathogenèse. En outre, le modèle de souris de hu-NSG réagit de façon appropriée à une thérapie antirétrovirale combinatoire (charrette) et récapitule le rebond viral plasmatique après le retrait de chariot, confirmant la mise en place d’un VIH latence réservoir25,26 ,,27. Ce réservoir de latence du VIH est étayé par la production d’aptes à la réplication du VIH virus ex vivo induite par l’homme au repos CD4 + T-cellules isolées de souris infectés et traités panier hu-NSG.

Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé pour la mise en place du modèle souris hu-NSG de souris néonatales de soins infirmiers, y compris les procédures relies au traitement du VIH infection et panier pour le développement de la latence. Nous espérons que ce protocole d’offrir un nouvel ensemble d’approches dans les études sur des animaux concernant le VIH virologie, latence et traitement du VIH.

Protocol

Tous les soins des animaux et des procédures ont été réalisées selon les protocoles revus et approuvés par la ville de Hope institutionnels Animal Care et utilisation Comité (IACUC) détenu par le chercheur principal de cette étude (Dr John Rossi, 12034 # IACUC). Tissu du foie foetal humain provient d’Advanced Bioscience ressources (Alameda, CA), un organisme sans but lucratif, conformément à la réglementation fédérale et d’état. Le vendeur a son propre Institutional Review Board (IRB) et est conforme a…

Representative Results

Analyse en cytométrie en flux est souvent effectué pour valider la pureté du CSH isolé, évaluer les niveaux de prise de greffe, le profil des réponses immunitaires aux infections virales et efficacité de chariot de l’enquête. Un panel d’anticorps typique contient des anticorps fluorescent étiquetés individuelles 4-6 ; ainsi, un cytomètre en flux avec plusieurs lasers et un large choix de filtres est crucial pour parvenir à des résultats précis. <p class="jove_conten…

Discussion

Des souris immunodéprimées greffés avec cellules/tissus humains présentent des caractéristiques physiologiques humanoïde et sont une valeur énorme pour les études de pathologie et physiopathologie, immunologie concernant les maladies spécifiques à l’homme. Parmi les nombreuses souches de souris immunodéficientes, le clin de œil. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji modèle (NSG) est la plus immunodéprimés en raison de son manque d’immunité innée et adaptative, ainsi que roussis cyt…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [subvention numéros R01AI29329, R01AI42552 et R01HL07470 à J.J.R.] et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health [numéro de licence P30CA033572 pour soutenir la ville de Hope génomique intégrative Pharmacologie analytique et des noyaux de cytométrie analytique]. Le réactif suivant a été obtenu par le biais de la NIH recherche sur le sida et le programme des réactifs de référence, Division of AIDS, NIAID, NIH : virus HIV BaL.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
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References

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Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
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