JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

Abstract

תקנות אתיות ואתגרים טכניים לחקר פתולוגיה אנושית, אימונולוגיה ופיתוח טיפולית יש להציב מודלים בעלי חיים קטנים ביקוש גבוה. עם קרוב גנטיות והתנהגותיות דימיון של בני אדם, חיות קטנות כמו העכבר הם מועמדים טובים עבור מחלות אנושיות מודלים, שדרכו תסמינים דמויי אנוש ותגובות יכול להיות recapitulated. יתר על כן, ניתן לשנות את הרקע הגנטי של העכבר כדי להתאים לדרישות מגוונות. העכברnull (NSG) הנד/SCID/IL2rγ הוא אחד של זנים העכבר immunocompromised הנפוצה ביותר; זה מאפשר engraftment עם תאי גזע אנושי hematopoietic ו/או ברקמות אנושיות ופיתוח עוקבות של מערכת החיסון האנושית פונקציונלי. . זה יהווה אבן דרך קריטית להבנת הפרוגנוזה של הפתופיזיולוגיה של האדם הספציפי מחלות כמו איידס, סיוע בחיפוש אחר תרופה… במסמך זה, מדווחים פרוטוקול מפורט ליצירת מודל העכבר NSG humanized (hu-NSG) על ידי השתלת תא גזע hematopoietic לתוך עכבר ממוזגים קרינה NSG neonatal. המודל העכבר hu-NSG מציגה פיתוח השושלת רב המושתלים תאי גזע אנושי הרגישות לזיהום נגיפי HIV-1. זה גם recapitulates מאפיינים ביולוגיים מרכזיים בתגובה לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה).

Introduction

כי הקמת בדגמים בעלי חיים מסוימים עבור מחלות אנושיות היא המפתח למציאת תרופה, מודלים בעלי חיים המתאימים זמן היה נרדף, שיפור לאורך זמן. פותחו זנים מרובים של מודלים מאתר immunocompromised, כי היתר את engraftment של רקמות או תאים אנושיים והוצאה לפועל עוקבות של פונקציות humanized1,2. מודל העכבר humanized שכזה הם קריטיים עבור חקירות של מחלות האדם הספציפי3,4,5.

אידס (איידס) הנובע זיהום עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) הוא דוגמה אחת. לפני הקמת העכבר humanized מודלים, אתיים ומגבלות טכניות מוגבלת HIV/איידס פרה מחקרים שנעשו בבעלי חיים קופים3. עם זאת, הוצאות גבוהה ודרישות עבור טיפול מיוחדים עבור חיה כזאת לעכב HIV/איידס בלימודים אקדמיים הגדרות אופייניות. HIV בעיקר מדביק CD4 + T-תאים אנושיים, משפיעה על פיתוח, תגובות מערכת החיסון של תאים חיסוניים אנושיים אחרים כגון תאי-B, מקרופאגים תאים דנדריטים6; לכן, מודלים בעלי חיים קטנים מושתלים עם תפקודי מערכות החיסון האנושית יש ביקוש גבוה.

פריצת דרך הגיע בשנת 1988, כאשר היו עכברים CB17 –scid עם מוטציה Prkdcscid פיתח והראה engraftment מוצלחת של מערכת החיסון האנושית1. התוצאות Prkdcscid מוטציה בפונקציות פגומים T – ו B-cell, מערכת חיסונית אדפטיבית ablated בעכברים, ובעקבותיו את engraftment של האדם ההיקפית תאי תאי (PBMCs), תאי גזע hematopoietic (HSCs), הדם, רקמות העובר hematopoietic7,8. עם זאת, רמות נמוכות של engraftment הם נצפו לעתים קרובות במודל זה; סיבות אפשריות הן 1) שיורית הפעילות החיסונית מולדת מאופנן באמצעות הרוצח הטבעיים (NK)-תאים ופיתוח 2) בשלב מאוחר של העכבר T – ו B-תאים (leakiness)5. התפתחות סוכרת שאינו שמנים (הנד) עוקבות-scid העכבר דגם מושגת דרמטי למטה-ויסות פעילות תאי NK; לפיכך, הוא מסוגל לתמוך לרמה גבוהה יותר engraftment בר-קיימא של רכיבי מערכת החיסון האנושית9. בכדי לדכא או לעכב התפתחות של מולדת חסינות, מודלים העכבר זוקף לחיתוך או מהממת של interleukin-2 קולטן γ-הרשת (Il2rg) (הנד) –scid רקע הוקמו. Il2rg, הידוע גם בשם נפוץ ציטוקין קולטן γ שרשרת, היא מרכיב חיוני של שונים ציטוקין קולטנים10,11,12,13. זנים כמו במנוד ראש. Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug (ליקר) נוכח שיבוש חזקים העכבר ציטוקין איתות ו אבלציה מלאה של התפתחות תאי NK, ב בנוסף ליקוי חמור של חסינות מסתגלת14,15,16.

שלושה דגמים העכבר humanized הנושאת scid מוטציה, נוקאאוט Il2rg לעתים קרובות המועסקים ב- HIV/איידס המחקר: המודל בייקון (מח עצם הכבד קורנית) את מודל למידה (ליקוציט דם היקפיים), המודל SRC (SCID לאכלס מחדש תא) 3. בייקון מודל נוצר באמצעות ניתוח השתלת כבד עוברי אנושי, התימוס מתחת הקפסולה כליות העכבר בליווי ורידיות העובר בכבד HSCs3,17,18. המודל העכבר BLT מציע יעילות גבוהה engraftment, התפתחות תאים אנושיים hematopoietic בתוך כל שושלות, והקמת מערכת חיסונית חזקה האנושי; בנוסף, תאי-T משכילים ב בלוטת התימוס עצמיים אנושית ולהציג מוגבלת הלע תגובות חיסוניות4,5,17,19. עם זאת, הדרישה ניתוחים נשאר החיסרון העיקרי של המודל BLT. המודל העכבר למידה נוסדה על ידי זריקה תוך ורידי עם תאי הלימפה היקפי אדם. מודל למידה מציע נוחות ותשואות engraftment T-cell מוצלחת, אבל היישום שלו הוא מוגבל בשל תאי B לא מספיק מיאלואידית תא engraftment, רמות נמוכות engraftment הכללית, ואת תחילתה של חמור שתל – מול – מארח מחלות (GVHD)3 ,20. המודל העכבר SRC נקבעת באמצעות הזרקה של האדם HSCs לתוך עכברים SCID היילוד או צעירים למבוגרים. זה מוצגים engraftment הממוצע יעילות מעל 25% (העריכו דם היקפיים CD45 אחוז) ותומך פיתוח מרובת-השושלת HSCs מוזרק, לפתח את מערכת החיסון האנושית מולדת. עם זאת, המגבלה של המודל SRC היא כי התגובה תא T הוא עכבר H2-מוגבל במקום האנושי מוגבלת הלע14,21.

המודל העכבר SRC נחשב למודל נתיישב ואמין פרה HIV/איידס קטן מחקרים שנעשו בבעלי חיים, ומעוררות את engraftment עקבית של מערכת החיסון האנושית ופיתוח hematopoietic מוצלח. אנו קודם לכן דיווח על הקמת מודל העכבר NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG), תיאר את היישום שלה שכפול HIV, השהיה מחקרים22,23,24. מודל זה העכבר hu-NSG תערוכות רמות גבוהות של מח עצם יונת, הרגישות הידבקות ב- HIV, ואת החוק הביוגנטי של הידבקות ב- HIV ו פתוגנזה. בנוסף, דגם hu-NSG העכבר מגיב כראוי לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), recapitulates פלזמה ריבאונד ויראלי על העגלה נסיגה, המאשרת הקמת HIV השהיה מאגר25,26 ,27. זה מאגר השהיה HIV עוד תימוכין על ידי הייצור של המוסמכים-שכפול HIV וירוסים לשעבר vivo המושרה על ידי האדם נח CD4 + T תאים מבודדים של עכברים נגועים ו שטופלו העגלה hu-NSG.

במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור הקמת המודל העכבר hu-NSG של עכברים NSG neonatal, לרבות ההליכים הקשורים זיהום ב- HIV וטיפול העגלה לפיתוח השהיה. אנו מצפים פרוטוקול זה להציע סט חדש של גישות במחקרים בעלי חיים HIV לגבי HIV וירולוגיה, השהיה, וטיפול.

Protocol

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים בוצעו על פי פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי עיר של תקווה מוסדיים חיה הטיפול ועל שימוש הוועדה (IACUC) שנערך על-ידי החוקר הראשי של מחקר זה (ד ר ג’ון רוסי, IACUC #12034). רקמת הכבד העובר האנושי הושג ממשאבים מתקדמים Bioscience (Alameda, CA), ארגון ללא מטרות רווח, על פי תקנות פדרליים ועל מ?…

Representative Results

ניתוח cytometry זרימה מתבצע בתדירות גבוהה כדי לאמת את טוהר HSCs מבודדים, להעריך את רמות engraftment, פרופיל החיסונית התגובות זיהום ויראלי, סקר העגלה היעילות. פאנל נוגדן טיפוסי מכיל נוגדנים fluorescently שכותרתו בודדים 4-6; לפיכך cytometer זרימה עם לייזרים מרובים ומבחר רחב של מסננים חיוני להשגת ת…

Discussion

עכברים immunocompromised engrafted עם תאים/רקמה אנושית להציג מאפיינים פיזיולוגיים דמוי אדם, ערך עצום ללימודי פתולוגיה, פתופיזיולוגיה ו אימונולוגיה לגבי אדם ספציפי במחלות. בין הזנים מרובים של עכברים immunocompromised, הסימן. Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) הדגם הוא immunodeficient ביותר בשל חוסר חסינות מולדת והן א?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [להעניק מספרים R01AI29329, R01AI42552, R01HL07470 J.J.R.] מכון הסרטן הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים [מספר גרנט P30CA033572 כדי לתמוך עיר של תקווה אינטגרטיבית גנומיקה פרמקולוגיה אנליטית, ליבות Cytometry אנליטית]. הכימית הבאה הושג באמצעות הפניה ריאגנט התוכנית, חלוקה של איידס, NIAID, ומחקר של איידס NIH NIH: HIV BaL וירוס.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Tags

Keywords: Hu-NSG Mouse ModelHIV ReplicationHIV LatencyNon-invasiveHuman Stem CellsCD34+ HSCsNOD/SCID/IL2rγnull MiceCARTHIV InfectionEngraftment ValidationFlow Cytometry
check_url/fr/58255?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image