Гуманизированные NOD/SCID/IL2rγзначение null (hu ГЯП) мыши модель репликации ВИЧ и задержка исследований
Summary
Этот протокол предоставляет метод для создания гуманизированные мышей (hu ГЯП) через внутрипеченочных инъекции гемопоэтических стволовых клеток человека в кондиционерами излучения новорожденных мышей ГЯП. Hu ГЯП мыши подвержены ВИЧ-инфекции и комбинаторная антиретровирусная терапия (корзину) и служит подходящей патофизиологические модели для репликации и задержка расследования ВИЧ.
Abstract
Этические правила и технические проблемы исследований в патологии человека, иммунологии и терапевтические развития поставили небольшие животные модели высоким спросом. С близкое сходство генетических и поведения людей мелких животных, таких как мыши являются хорошими кандидатами для болезней человека модели, через которые можно резюмировалась человека как симптомы и ответы. Кроме того генетический фон мыши могут быть изменены для удовлетворения различных потребностей. Кивок/SCID/IL2rγзначение null (ГЯП) Мышь является одним из наиболее широко используемых штаммов ослабленным мыши; Это позволяет приживления гемопоэтических стволовых клеток человека или ткани человека и последующего развития функциональной иммунной системы человека. Это критически важной вехой в понимании prognosis и Патофизиология человека конкретных заболеваний, как ВИЧ/СПИД и пособничество Поиск для лечения. Здесь мы доклад подробный протокол для генерации гуманизированные модель мыши ГЯП (hu ГЯП), трансплантация гемопоэтических стволовых клеток в мышь излучения кондиционером новорожденных ГЯП. Hu ГЯП мыши модель показывает мульти линии развития пересаженные стволовые клетки человека и восприимчивость к вирусной инфекции ВИЧ-1. Он также повторяет ключевые биологические характеристики в ответ комбинаторная антиретровирусная терапия (корзину).
Introduction
Поскольку создание подходящих животных моделей для заболеваний человека является ключом к поиску лечения, соответствующие животных модели долго преследовал и улучшить со временем. Были разработаны несколько штаммов ослабленным мышиных моделях, которые позволяют приживления человеческих клеток или тканей и последующего исполнения гуманизированные функций1,2. Такие модели гуманизированные мыши являются критическими для исследования человека конкретных заболеваний3,4,5.
Одним из примеров является синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) в результате заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). До создания моделей гуманизированные мышей этические и технические ограничения замкнутых ВИЧ/СПИДа доклинические исследования на животных в нечеловеческих приматов3. Однако исследования ВИЧ/СПИДа в типичных академических параметры препятствуют высокие расходы и требования к специализированной помощи для таких животных. Главным образом ВИЧ заражает CD4 + Т-клеток человека и влияет на развитие и иммунные реакции других людей иммунных клеток, такие как B-клетки, макрофаги и дендритные клетки6; Таким образом малые животные модели, пересаженные с функциональной иммунной системы человека пользуются высоким спросом.
Прорыв произошел в 1988 году, когда CB17 –ТКИД мышей с Prkdcscid мутации были разработаны и показал успешного приживления иммунной системы человека1. Результаты мутации Prkdcscid дефектные Т – и B-клеток функций и ablated адаптивной иммунной системы мышей, тем самым позволяя приживления человека периферической крови мононуклеаров (получения), гемопоэтических стволовых клеток (СКК), и 7,фетальных кроветворных тканей8. Тем не менее низкий уровень приживления часто наблюдаются в этой модели; возможные причины являются 1) остаточных врожденной иммунной активности, модулированные через естественный убийца (NK)-клетки и 2) поздней стадии развития мыши Т – и B-клетки (утечки)5. Последующее развитие-ожирением диабетом (НОД)-модель мышиscid достигнуто резкое вниз регулирование активности НК клеток; Таким образом она может поддерживать более высокий уровень и более устойчивого приживления компоненты иммунной системы человека9. Для дальнейшего подавления или препятствуют развитию врожденного иммунитета, мыши модели с учетом усечения или всего нокаут рецептора интерлейкина-2 γ-цепи (Il2rg) (НОД) –ТКИД фон были созданы. Il2rg, также известный как общие cytokine рецептор γ-цепи, является неотъемлемым компонентом различных цитокинов рецепторов10,11,12,13. Штаммы например КИВНУЛ. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (ГЯП) и NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (Нагель) представлять надежные срыв мыши цитокина сигнализации и полное аблация развития НК клеток, в дополнение к серьезным сбоям в работе адаптивного иммунитета14,,1516.
Три модели гуманизированные мыши, учитывая scid , мутации и Il2rg нокаут часто заняты в исследований ВИЧ/СПИДа: BLT (костного мозга/печени/Thymus) модели, ПБЛ (лейкоцитов периферической крови) и SRC (SCID заселив клеток) модель 3. BLT модель создается через хирургической трансплантации человеческих фетальной печени и тимуса под капсулу почки мыши, наряду с внутривенным введением плода печени СКК3,17,18. BLT мыши модель предлагает высокий приживления эффективность, развитие гемопоэтических клеток человека в всех родов и создание сильной иммунной системы человека; Кроме того Т-клетки обучаются в человека аутологичной тимуса и выставку HLA-ограничено иммунных ответов4,5,17,19. Однако потребность в хирургических процедур остается основным недостатком модели BLT. ПБЛ мыши модель устанавливается внутривенные инъекции с периферических лимфоидных клеток человека. ПБЛ модель предлагает удобство и дает успешного приживления Т-клеток, но его применение ограничено из-за недостаточного B-клеток и приживления миелоидных клеток, низкой приживления уровни общего и наступления заболевания тяжелой трансплантат – versus – хост (GVHD)3 ,20. SRC мыши модель устанавливается путем инъекции человеческого СКК в новорожденного или молодых взрослых SCID мышей. Его экспонаты приживления средняя эффективность выше 25% (по оценке как периферической крови CD45 процент) и поддерживает множественные линии развития вводят СКК и разработке врожденной иммунной системы человека. Однако модель SRC ограничены, что Т-клеточный ответ является мыши H2-ограниченных вместо человека HLA-ограничена14,21.
Легкая и надежная модель для доклинических ВИЧ/СПИДа небольших исследованиях на животных, свидетельствует последовательное приживления иммунной системы человека и успешного развития гемопоэтических считается модель мыши SRC. Ранее мы сообщили о создании модели мыши ГЯП Ху-SRC-ТКИД (hu ГЯП) и описал его применение в репликации ВИЧ и задержка исследования22,23,24. Эта модель мыши Ху ГЯП демонстрирует высокий уровень костного самонаведения, восприимчивость к инфекции ВИЧ и повторение инфекции ВИЧ и патогенез. Кроме того модель мыши Ху ГЯП реагирует надлежащим образом на комбинаторная антиретровирусная терапия (корзину) и резюмирует плазмы вирусный отскок после вывода корзину, подтверждающее создание ВИЧ задержка водохранилище25,26 ,27. Это водохранилище задержка ВИЧ далее подтверждается производства компетентным репликации ВИЧ вирусов ex vivo индуцированных человека отдыха CD4 + T-клетки изолированы от инфицированных и корзину лечение Ху ГЯП мышей.
Здесь мы описываем подробный протокол для создания модели мыши Ху ГЯП от новорожденных мышей ГЯП, включая процедуры, связанные с лечения ВИЧ инфекции и корзину для задержки развития. Мы ожидаем этот протокол предложить новый набор подходов в исследованиях на животных ВИЧ относительно ВИЧ вирусологии, задержки и лечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ослабленным иммунитетом мышей прижившимися с клеток/тканей человека являются физиологические характеристики человека как и огромную ценность для иммунологии, патологии и патофизиологии исследований, касающихся человека конкретных заболеваний. Среди нескольких штаммов ослабленным…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения [предоставить номера R01AI29329, R01AI42552 и R01HL07470 J.J.R.] и Национальный институт рака, национальные институты здравоохранения [номер гранта P30CA033572 для поддержки город надежды интегративной геномики Аналитических фармакологии и аналитических цитометрии ядер]. Следующие реагент был получен через низ исследования СПИДа и ссылка реагент программы, Отдел СПИДа, NIAID, низ: вирус ВИЧ бал.
Materials
| CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
| CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
| IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
| Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
| Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
| Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
| Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
| Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
| Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
| QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
| TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
| HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
| IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
| Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
| APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
| PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |
References
- Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
- Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
- McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
- Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
- King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
- Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
- Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
- Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
- Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
- Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
- Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
- Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
- van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
- Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
- Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
- Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
- Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
- Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
- Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).
