JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

İnsanlaşmış NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) fare modeli HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Bu iletişim kuralı radyasyon şartına yenidoğan NSG fareler içine insan hematopoetik kök hücre intrahepatic enjeksiyon yoluyla insanlaşmış fareler (hu-NSG) kurmak için bir yöntem sağlar. Hu-NSG fare duyarlı HIV enfeksiyonu ve kombinatorik antiretroviral tedavi (sepet) ve HIV çoğaltma ve gecikme süresi incelemeler için uygun bir patofizyolojik model olarak hizmet vermektedir.

Abstract

Etik kuralları ve teknik sorunlar için araştırma insan patoloji, immünoloji ve terapötik geliştirme küçük hayvan modelleri yüksek talep soktuk. Yakın bir genetik ve davranışsal benzerlik ile insanlar, fare gibi küçük hayvan insan hastalık modelleri, hangi aracılığıyla insan benzeri belirtiler ve yanıt-e doğru recapitulated için iyi adaylardır. Ayrıca, fare genetik arka plan çeşitli talepleri karşılamak için değiştirilebilir. NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) fare en çok kullanılan immün fare suşları biridir; engraftment ile insan hematopoetik kök hücre ve/veya insan doku ve işlevsel bir insan bağışıklık sisteminin sonraki geliştirme sağlar. Bu prognoz ve insan özgü hastalıklar HIV/AIDS gibi Patofizyoloji anlama ve tedavi için arama yardım önemli bir kilometre taşıdır. Burada, hematopoetik kök hücre transplantasyonu radyasyon şartına yenidoğan NSG fare içine tarafından bir insanlaşmış NSG fare modeli (hu-NSG) oluşturmak için ayrıntılı bir protokol rapor. Hu-NSG fare modeli çoklu soy gelişme HIV-1 viral enfeksiyon duyarlılık ve transplante insan kök hücreleri gösterir. Ayrıca Kombinatorik antiretroviral tedavi (sepeti) karşılık olarak anahtar biyolojik özellikleri beyannamedir.

Introduction

İnsan hastalıkları uygun hayvan modellerinde kurulması için bir çare bulma anahtar olduğundan, uygun hayvan modelleri uzun edilmiş takip ve zaman içinde geliştirilmiş. Birden fazla immün fare modelleri suşların engraftment insan hücreleri ve/veya doku ve insanlaşmış işlevleri1,2sonraki yürütülmesine izin veren geliştirdik. İnsanlaşmış fare modelleri gibi insan özgü hastalıklar3,4,5araştırmalar için kritik öneme sahiptir.

Edinilmiş bağışıklık yetersizliği Sendromu (AIDS) enfeksiyon human Immunodeficiency virus (HIV) ile sonuçlanan bir örnektir. İnsanlaşmış fare modelleri kurulması önce etik ve teknik sınırlamalar HIV/AIDS preklinik hayvan çalışmaları insan dışı primatlar3sınırlı. Ancak, yüksek gider ve bu tür hayvan için özel bakım için gereksinimleri normal akademik ayarlar çalışmalarda HIV/AIDS engel. HIV öncelikle insan CD4 + T-hücreleri bozar ve gelişme ve bağışıklık yanıtı B-hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreleri6gibi diğer insan bağışıklık hücrelerinin etkiler; Bu nedenle, fonksiyonel insan bağışıklık sistemleri ile nakledilen küçük hayvan yüksek talep modellerdir.

Bir atılım CB17 –scid fareler Prkdcscid mutasyon ile geliştirilmiş olup, insan bağışıklık sistemi1‘ in başarılı engraftment gösterdi otelde 1988’de geldi. Arızalı T ve B hücre fonksiyonları Prkdcscid mutasyon sonuçlarında ve farelerde ablated edinilmiş bağışıklık sistemi, böylece insan periferik engraftment etkinleştirme kan mononükleer hücreler (PBMCs), hematopoetik kök hücre (HSCs), ve Fetal hematopoetik doku7,8. Yine de, engraftment seviyesinin düşük sık sık bu modelde gözlenen; olası nedenleri şunlardır 1) kalan doğuştan gelen bağışıklık etkinlik doğal öldürücü (NK) yolu ile modüle-hücreleri ve 2) fare T ve B hücreleri (leakiness)5son aşama geliştirilmesi. Obez olmayan diyabetik (NOD) sonraki gelişimi-scid fare modeli elde dramatik aşağı-Yönetmeliğin NK hücre faaliyet; Böylece, daha yüksek bir seviyeye ve insan bağışıklık sistemi bileşenleri9daha fazla sürdürülebilir engraftment desteklemek yapabiliyor. Daha fazla bastırmak veya kesilmesi veya interleukin-2 reseptör γ-zinciri (Il2rg) Toplam nakavt (sallama) taşıyan fare modelleri doğuştan gelen bağışıklık, gelişimine engel –scid arka plan kuruldu. Il2rg, olarak da bilinen ortak sitokin reseptör γ-zinciri, çeşitli sitokin reseptörleri10,11,12,13, vazgeçilmez bir bileşenidir. Suşları başını sallamak gibi. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) ve NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (takoz) mevcut fare sitokin sinyal sağlam bozulma ve tam ablasyon NK hücre gelişimi içinde edinilmiş bağışıklığın14,15,16ağır bozukluğu için ek.

Mutasyon ve Il2rg nakavt scid taşıyan üç insanlaşmış fare modelleri sık HIV/AIDS araştırma istihdam edilmektedir: BLT (kemik iliği/karaciğer/timus) model PBL (periferik kan lökosit) model ve SRC (SCID kullanıma hücre) modeli 3. BLT modeli insan fetal karaciğer ve timus fetal karaciğer HSCs3,17,18İntravenöz enjeksiyon ile eşlik fare böbrek kapsülü altında cerrahi nakli yoluyla oluşturulur. BLT fare modeli yüksek engraftment yeterlik, Bütün soy insan hematopoetik hücrelerin gelişimi ve güçlü bir insan bağışıklık sistemi kurulması sunar; Ayrıca, T-hücreleri bir insan otolog timus eğitimli ve HLA-sınırlı bağışıklık yanıtı4,5,17,19sergi. Ancak, cerrahi işlemler gereksinimini BLT modelinin önemli dezavantajı kalır. PBL fare modeli ile insan periferik lenfoid hücreleri Intravenöz enjeksiyon tarafından kurulmuştur. PBL modeli kolaylık sunuyor ve başarılı T-hücre engraftment verir, ancak uygulama yetersiz B-hücre ve myeloid hücre engraftment, düşük engraftment seviyeleri genel ve ağır graft – versus – host hastalığı (GVHD)3 başlangıçlı nedeniyle sınırlıdır ,20. SRC fare modeli insan HSCs enjeksiyonuyla yeni doğan veya Genç Yetişkin SCID fareler içine kuruldu. Bu ortalama engraftment verimliliği % 25 (periferik kan CD45 yüzde değerlendirildi) yukarıda sergiler ve enjekte HSCs çoklu-lineage gelişimi ve doğuştan gelen bir insan bağışıklık sistemi hazırlama destekler. Ancak, SRC model T hücreli yanıt olduğunu fare olduğunu H2 tarafından kısıtlanmış insan HLA-sınırlı14,21yerine kısıtlamasıdır.

SRC fare modeli tarafından bir insan bağışıklık sistemi ve başarılı hematopoetik geliştirme engraftment tutarlı örneği preklinik HIV/AIDS küçük hayvan çalışmaları için facile ve güvenilir bir model olarak kabul edilir. Biz daha önce bir NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) fare modeli kurulması bildirdi ve HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları22,23,24kendi uygulamasında açıklanan. Bu hu-NSG fare modeli kemik iliği posta, HIV enfeksiyonu duyarlılık düzeyi yüksek ve HIV enfeksiyonu ve Patogenez Rekapitülasyon sergiler. Ayrıca, hu-NSG fare modeli uygun şekilde Kombinatorik antiretroviral tedavi (sepeti) yanıt verir ve plazma viral rebound sepeti çekilmesi, bir HIV gecikme süresi rezervuar25,26 kurulması teyit üzerine tablodur ,27. Bu HIV gecikme süresi rezervuar daha fazla insan CD4 + T-hücreleri enfekte ve sepeti tedavi hu NSG fareler izole dinlenme tarafından indüklenen çoğaltma yetkili HIV virüs ex vivo üretim tarafından kanıtlanmış.

Burada, yenidoğan NSG fare gecikme süresi Kalkınma HIV enfeksiyonu ve sepeti tedavisi ile ilgili yordamları da dahil olmak üzere, hu-NSG fare modelinden kurulması için detaylı protokolü açıklar. Yeni HIV hayvan çalışmaları HIV Viroloji, gecikme süresi ve tedavi ile ilgili yaklaşımlar sunar için bu iletişim kurallarını bekliyoruz.

Protocol

Tüm hayvan bakımı ve yordamları gözden geçirilmiş ve şehir, umut hayvan Kurulusları tarafından onaylanmış iletişim kuralları ve kullanım Komitesi (IACUC) (Dr. John Rossi, IACUC #12034) Bu çalışmada yürütücü tarafından düzenlenen göre gerçekleştirilmiş. İnsan fetal karaciğer dokusu gelişmiş Bioscience kaynaklardan (Alameda, CA), kar amacı gütmeyen bir organizasyon, federal ve eyalet düzenlemelerine uygun olarak elde edildi. Satıcının kendi kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve insan konu…

Representative Results

Akış Sitometresi Analizi sık izole HSCs saflığı doğrulamak, engraftment seviyesini, viral enfeksiyon, profil bağışıklık yanıtlarını ve sepeti etkinliği anket yapılır. Tipik antikor panelinde 4-6 bireysel fluorescently etiketli antikorlar bulunur; Böylece, bir akış sitometresi birden çok lazerler ve filtreleri geniş bir seçki ile doğru sonuçlar elde edilmesi için önemlidir. İlk engraftment doğrulama,…

Discussion

İmmün fare insan hücreleri/dokusu ile engrafted insan benzeri fizyolojik özellikleri sunmak ve insan özgü hastalıklar ile ilgili patoloji, patofizyolojisi ve İmmünoloji çalışmalar için çok büyük bir değeri vardır. İmmün fareler, NOD birden fazla suşları arasında. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modelidir en immünyetmezligi3,12,19 sinyal ablated fare özgü sitokin yanı sıra doğ…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Ulusal [numaraları R01AI29329, R01AI42552 ve R01HL07470 J.J.R. için vermek] Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [grant numarası P30CA033572 şehir umut bütünleştirici genomik desteklemek için Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir Analitik Farmakoloji ve analitik sitometresi çekirdek]. Aşağıdaki reaktif NIH AIDS araştırma ve başvuru reaktif Program, bölünme AIDS, NIAID, NIH elde edildi: HIV BaL virüs.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Tags

Hu-NSG Mouse ModelHIV ReplicationHIV LatencyNon-invasiveHuman Stem CellsCD34+ HSCsNOD/SCID/IL2rγnull MiceCARTHIV InfectionEngraftment ValidationFlow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image