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Immunologie et infection

Umanizzato NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse modello per studi di latenza e di replicazione dell'HIV

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Questo protocollo fornisce un metodo per stabilire topi umanizzati (hu-NSG) tramite iniezione intraepatica di cellule staminali ematopoietiche umane nella radiazione-condizionato topi NSG neonatali. Il mouse di hu-NSG è suscettibile di infezione da HIV e combinatorio antiretrovirale di combinazione (cART) e serve come un modello fisiopatologico adatto per le indagini di replica e la latenza di HIV.

Abstract

Norme etiche e sfide tecniche per la ricerca in patologia umana, immunologia e sviluppo terapeutico sono collocati piccoli modelli animali in forte domanda. Con una stretta somiglianza genetica e comportamentale agli esseri umani, piccoli animali come il mouse sono buoni candidati per i modelli di malattia umana, attraverso il quale possono essere ricapitolate le risposte e umano-come i sintomi. Ulteriormente, il background genetico del mouse possa essere modificato per soddisfare le diverse esigenze. Il mouse NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) è uno dei più utilizzati ceppi di topo immunocompromessi; Esso consente di attecchimento con cellule staminali ematopoietiche umane e/o tessuti umani e lo sviluppo successivo di un funzionale sistema immunitario umano. Questo è un traguardo fondamentale nella comprensione della prognosi e la fisiopatologia delle malattie umane specifiche quali l’HIV/AIDS e favorendo la ricerca di una cura. Qui, segnaliamo un protocollo dettagliato per la generazione di un modello di topo umanizzato NSG (hu-NSG) da trapianto di cellule staminali ematopoietiche in un mouse NSG neonatale e radiazione-condizionati. Il modello di mouse hu-NSG illustra lo sviluppo multi-stirpe di cellule staminali umane trapiantate e suscettibilità all’infezione virale di HIV-1. Esso riassume anche chiave caratteristiche biologiche in risposta alla terapia antiretrovirale combinatoria (cART).

Introduction

Perché stabilire idonei modelli animali di malattie umane è la chiave per trovare una cura, modelli animali appropriati sono stati a lungo perseguiti e migliorati nel tempo. Più ceppi di modelli murini immunocompromessi sono stati sviluppati che permettono l’attecchimento di cellule umane e/o tessuti e la successiva esecuzione di funzioni umanizzato1,2. Tali modelli umanizzato del topo sono fondamentali per le indagini di malattie umane specifiche3,4,5.

Sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) derivando dall’infezione con il virus di immunodeficenza umana (HIV) è un esempio. Prima della creazione di modelli murini umanizzati, limitazioni etiche e tecniche confinati gli studi sugli animali preclinici di HIV/AIDS a primati non umani3. Tuttavia, le alte spese e requisiti per cure specialistiche per tale animale ostacolano gli studi di HIV/AIDS nel tipici ambiente accademico. HIV soprattutto infetta CD4 + T-cellule umane e impatta lo sviluppo e le risposte immunitarie di altre cellule immuni umane quali linfociti B, macrofagi e cellule dendritiche6; di conseguenza, piccoli modelli animali trapiantati con funzionale del sistema immunitario umani sono in forte domanda.

Una svolta è arrivata nel 1988, quando CB17 –scid topi con una mutazione di Prkdcscid sono stati sviluppati e ha mostrati il riuscito engraftment del sistema immunitario umano1. I risultati di mutazione Prkdcscid nelle funzioni a cellula T e B difettosa e un sistema immunitario adattativo ablato in topi, consentendo l’attecchimento del periferico umano cellule mononucleari (PBMCs), cellule staminali ematopoietiche (HSCs), del sangue e tessuti ematopoietici fetali7,8. Ciò nonostante, i bassi livelli di attecchimento sono osservati frequentemente in questo modello; le cause possibili sono 1) residua attività immunitaria innata modulata tramite natural killer (NK)-cellule e 2) il fase avanzata di sviluppo del mouse T – e B-cellule (permeabilità)5. Lo sviluppo successivo dei diabetici non obesi (NOD)-modello del toposcid raggiunto drammatico giù-regolamento dell’attività delle cellule NK; così, è in grado di supportare un livello superiore e attecchimento più sostenibile del sistema immunitario umano componenti9. Ad ulteriori sopprimere o ostacolare lo sviluppo dell’immunità innata, modelli di mouse tenendo troncamento o KO totale della interleuchina 2 recettore γ-catena (Il2rg) (NOD) – sfondo discid sono stati stabiliti. Il2rg, noto anche come comune citochina-recettore γ-catena, è una componente indispensabile di varie citochine recettori10,11,12,13. Ceppi come cenno del capo. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) e NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentare robusta rottura del mouse cytokine signaling e ablazione completa dello sviluppo della NK-cellula, in oltre a grave compromissione della risposta immunitaria adattativa14,15,16.

Tre modelli di mouse umanizzato recanti un scid mutazione e Il2rg knockout sono frequentemente impiegati nella ricerca sull’HIV/AIDS: il modello di BLT (midollo osseo/fegato/timo), il modello PBL (leucociti di sangue periferico) e il modello SRC (SCID Repopulating cella) 3. the BLT modello viene creato tramite il trapianto chirurgico del fegato fetale umano e timo sotto la capsula del rene del mouse accompagnato con l’iniezione endovenosa del fegato fetale HSCs3,17,18. Modello del topo BLT offre engraftment alta efficacia, sviluppo delle cellule ematopoietiche umane in tutte le stirpi e istituzione di un forte sistema immunitario umano; Inoltre, le cellule T sono istruite in un timo umano autologo e mostrano HLA-restricted risposte immunitarie4,5,17,19. Tuttavia, il requisito per le procedure chirurgiche rimane il principale svantaggio del modello BLT. Modello del topo PBL è stabilito tramite l’iniezione endovenosa con cellule linfoidi periferiche umane. Il modello PBL offre convenienza e produce riuscito engraftment delle cellule T, ma la sua applicazione è limitata a causa della insufficiente della B-cellula ed engraftment delle cellule mieloidi, attecchimento basso livelli complessivi e l’insorgenza della malattia di grave dell’innesto – contro – ospite (GVHD)3 ,20. Modello del topo SRC viene stabilito tramite iniezione di HSCs umano nel neonato o giovani adulti topi SCID. Si esibisce engraftment media efficienza superiori al 25% (valutato come sangue periferico CD45 percentuale) e supporta lo sviluppo di multiplo-stirpe di HSCs iniettato e l’elaborazione di un sistema immunitario umano innato. Tuttavia, la limitazione del modello SRC è che la risposta a cellula T è mouse H2-limitati invece umani HLA-restricted14,21.

Modello del topo SRC è considerato un modello affidabile e facile per l’HIV/AIDS piccolo animali studi preclinici, esemplificato dal engraftment coerenza di un sistema immunitario umano e positivo sviluppo ematopoietico. Precedentemente abbiamo segnalato l’istituzione di un modello murino di NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) e descritto la sua applicazione nella replicazione dell’HIV e latenza studi22,23,24. Questo modello del topo di hu-NSG presenta alti livelli di homing di midollo osseo, suscettibilità all’infezione da HIV e ricapitolazione dell’infezione da HIV e patogenesi. Inoltre, il modello del mouse di hu-NSG risponde in modo appropriato alla terapia antiretrovirale combinatoria (carrello) e ricapitola il rebound virale del plasma al momento del ritiro del carrello, confermando l’istituzione di un HIV latenza serbatoio25,26 ,27. Questo serbatoio di latenza di HIV è suffragato dalla produzione di replica-competente di virus HIV ex vivo indotta da umani CD4 + T-cellule isolate da topi infetti e carrello-trattati hu-NSG di riposo.

Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per l’istituzione del modello del topo di hu-NSG dai topi NSG neonatali, incluse le procedure relazionate al trattamento dell’HIV infezione e carrello per lo sviluppo di latenza. Ci aspettiamo che questo protocollo per offrire una nuova serie di approcci in studi su animali per quanto riguarda l’HIV virologia, latenza e trattamento HIV.

Protocol

Tutti cura degli animali e le procedure sono state eseguite secondo protocolli esaminati e approvati dalla città della speranza istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) tenuto dal ricercatore principale di questo studio (Dr. John Rossi, IACUC n. 12034). Tessuto epatico fetale umano è stato ottenuto da Advanced Bioscience risorse (Alameda, CA), un’organizzazione senza scopo di lucro, in conformità alle norme federali e statali. Il fornitore ha la propria Institutional Review Board (IRB) ed è conforme ai req…

Representative Results

Analisi di citometria a flusso è effettuato frequentemente per convalidare la purezza di HSCs isolato, valutare i livelli di attecchimento, profilo risposta immunitaria all’infezione virale ed efficacia di carrello di indagine. Un pannello di anticorpi tipico contiene anticorpi fluorescente contrassegnati individuali di 4-6; così, un citometro a flusso con più laser e una vasta selezione di filtri è cruciale per il raggiungimento di risultati accurati. <p class="jove_content" fo:k…

Discussion

Topi immunocompromessi innestati con cellule/tessuti umani presentano caratteristiche fisiologiche simili all’uomo e un enorme valore per gli studi di patologia, fisiopatologia e immunologia relative alle malattie umane specifiche. Tra più ceppi di topi immunocompromessi, il cenno del capo. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modello è il più immunodeficiente a causa della sua mancanza di sia innata che adattativa, nonché ablato specifici del mouse cytokine signaling3</sup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [sovvenzione numeri R01AI29329, R01AI42552 e R01HL07470 J.J.R] e National Cancer Institute, del National Institutes of Health [concessione numero P30CA033572 per sostenere la città della speranza Integrative Genomics Farmacologia analitica e analisi Cytometry core]. Il reagente seguente è stato ottenuto attraverso la ricerca sull’AIDS NIH e riferimento reagente programma, divisione di AIDS, NIAID, NIH: virus HIV BaL.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
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References

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Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
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