उत्पादत्मक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट्स के साथ P1 Transduction द्वारा ई कोलाई में जीन विलोपन का उत्पादन
Summary
यहां हम पूर्व के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एंटीबायोटिक प्रतिरोध-कैसेट विलोपन अंय ई. कोलाई उपभेदों में हटाने म्यूटेंट बनाने के लिए एक आधार के रूप में निर्माण । ऐसे विलोपन उत्परिवर्तनों जुटाया जा सकता है और एक प्राप्तकर्ता P1 भोजी transduction का उपयोग कर तनाव के इसी लोकस में डाला ।
Abstract
एक पहले दृष्टिकोण के लिए बैक्टीरिया में एक अज्ञात जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए एक दस्तक इस जीन का बना है । यहां, हम भोजी P1 के साथ सामान्यीकृत transduction का उपयोग करके एक दूसरे के लिए एक ई कोलाई तनाव से जीन विलोपन उत्परिवर्तनों के हस्तांतरण के लिए एक मजबूत और तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन । इस विधि की आवश्यकता है कि उत्परिवर्तन चयन किया जा (जैसे, जीन व्यवधान एंटीबायोटिक कैसेट निवेशन का उपयोग कर के आधार पर) । इस तरह के एंटीबायोटिक कैसेट एक दाता तनाव से जुटाया जा सकता है और ब्याज की एक प्राप्तकर्ता तनाव में शुरू करने के लिए जल्दी और आसानी से एक जीन विलोपन उत्परिवर्ती उत्पंन । एंटीबायोटिक कैसेट को flippase मांयता साइटों है कि एक साइट द्वारा कैसेट के उत्पाद विशेष recombinase एक साफ नॉक आउट केवल एक ~ १००-आधार जोड़ी-जीनोम में लंबे निशान अनुक्रम के साथ उत्पादन की अनुमति शामिल डिजाइन किया जा सकता है । हम एक विधानसभा में शामिल तम जीन एंकोडिंग के द्वारा प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ट्रांसपोर्टर के साथ जुड़े हुए हैं और इस नॉक-आउट के प्रभाव का परीक्षण करते हैं, जो दो trimeric ट्रांसपोर्टर adhesins के काम करते हैं । हालांकि P1 transduction द्वारा जीन विलोपन अपनी सीमाओं, आसानी और उसके कार्यांवयन की गति है यह जीन विलोपन के अंय तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प है ।
Introduction
एक आम पहले दृष्टिकोण के लिए एक जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए दस्तक mutagenesis बाहर प्रदर्शन और परिणामस्वरूप phenotype का निरीक्षण है । यह भी रिवर्स आनुवंशिकी का कार्यकाल है । जीवाणु ई. कोलाई पिछले ७० साल या तो के लिए आणविक जीवविज्ञान के workhorse गया है, अपनी संवर्धन और आनुवंशिक हेरफेर1के लिए अपनी सुविधा की आसानी की वजह से । कई तरीकों ई. कोलाईमें जीन विलोपन का उत्पादन करने के लिए विकसित किया गया है, मार्कर एक्सचेंज mutagenesis सहित2,3 और, अधिक हाल ही में, recombineering का उपयोग कर λ लाल या आरएसी एट सिस्टम4,5 , 6.
एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली में, व्यक्तिगत जीन की कोडिंग अनुक्रम एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट है कि बाद में5गुणसूत्र,7से उत्पादीकरण किया जा सकता है द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं । कोडिंग अनुक्रम, उदाहरण के लिए एक कनमीसिन (कान) प्रतिरोध कैसेट, जो flippase (FLP) मांयता लक्ष्य (FRT) दोनों ओर साइटों द्वारा पार्श्व है द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं । FRT साइटों recombinase FLP, जो FRT कान कैसेट के विलोपन के लिए अग्रणी साइटों के बीच साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन मध्यस्थता द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । इस तरह, एक दिया है जीन कोडिंग अनुक्रम का पूरा विलोपन प्राप्त किया जा सकता है, लगभग १०० आधार जोड़े (बीपी) (चित्रा 1) के केवल एक ंयूनतम निशान अनुक्रम पीछे जा ।
बस एक दशक से अधिक पहले, तथाकथित कईयो संग्रह विकसित किया गया था । यह एक जीवाणु एक मानक प्रयोगशाला ई. कोलाई K12 तनाव, पर आधारित पुस्तकालय है, जहां लगभग सभी गैर आवश्यक जीन व्यक्तिगत रूप से λ लाल पुनर्संयोजन द्वारा नष्ट कर दिया गया7,8। इस संग्रह के भीतर क्लोन प्रत्येक एक कोडन अनुक्रम एक उत्पादत्मक कान प्रतिरोध कैसेट के साथ प्रतिस्थापित किया है । कईयो संग्रह के लिए कई आवेदन9के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित हो गया है । ऐसा ही एक आवेदन अंय ई. कोलाई उपभेदों में विलोपन म्यूटेंट का उत्पादन है । एक दिया विलोपन क्लोन से कान कैसेट ऐसे P110,11,12,13,14के रूप में आम तौर पर transducing bacteriophages, द्वारा जुटाया जा सकता है । एक फेज इस तरह के एक तनाव से तैयार स्टॉक तो ब्याज की एक प्राप्तकर्ता ई. कोलाई तनाव को संक्रमित किया जा सकता है, जहां एक कम लेकिन विश्वसनीय आवृत्ति पर कान कैसेट युक्त क्षेत्र मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा प्राप्तकर्ता जीनोम में शामिल किया जा सकता है (चित्रा 2) । Transductants के लिए कान युक्त मध्यम पर विकास के लिए चुना जा सकता है । इस के बाद, यदि एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट को हटाने वांछित है, FLP recombinase ट्रांस में transductant तनाव को आपूर्ति की जा सकती है । FLP युक्त प्लाज्मिड, जो एक एम्पीसिलीन (amp) प्रतिरोध मार्कर, कान और amp के प्रति संवेदनशील क्लोन किया जाता है इलाज के बाद, और जंगली प्रकार कोडिंग अनुक्रम और कान कैसेट के सही उत्पाद कॉलोनी पीसीआर द्वारा सत्यापित कर रहे हैं ।
यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, एक नॉक आउट ई. कोलाई ऊपर उल्लिखित रणनीति के आधार पर तनाव के उत्पादन में कदम से प्रत्येक का वर्णन । उदाहरण के रूप में, तम जीन को हटाने का प्रदर्शन किया जाता है । तम encodes एक बाहरी झिल्ली β-बैरल प्रोटीन है कि परिवहन और विधानसभा मॉड्यूल (टैम), जो कुछ ही ट्रांसपोर्टर प्रोटीन और पिली15,16,17की उत्पत्ति में शामिल है का एक हिस्सा है । इस नॉक आउट तनाव के कारण दो trimeric के adhesins (ताळा), Yersinia adhesin बेकार और ई. कोलाई immunoglobulin (़)-बाध्यकारी ताा EibD की उत्पत्ति पर तमोगुण विलोपन के प्रभाव की जांच की गई । 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
P1 transduction ई. कोलाईमें जीन विलोपन पैदा करने के लिए एक तेज, मजबूत, और विश्वसनीय तरीका है । यह यहां transducing द्वारा एक कईयो दाता तनाव से एक BL21-व्युत्पंन प्राप्तकर्ता को एक तम विलोपन उत्परिवर्ती प्रदर्शन किया …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कईयो संग्रह उपभेदों राष्ट्रीय संसाधन परियोजना (काटकर चिकना करना, जापान): ई. कोलाईसे प्राप्त किया गया । हम अपने सतत समर्थन के लिए कटार लिंक (विज्ञान विभाग, ओस्लो विश्वविद्यालय) धंयवाद । यह काम नॉर्वे के युवा शोधकर्ता अनुदान २४९७९३ के अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया (जैक सी लियो को) ।
Materials
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
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