게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략
Summary
여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.
Abstract
이진 전송 시스템은 강력한 유전적 도구를 시각화 하 고 조작 하는 셀의 특정 그룹에서 세포 운명과 유전자 식 또는 조직 모형 유기 체에서 널리 이용 되는. 이러한 시스템 별도 유전자 변형 라인으로 두 개의 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 드라이버 라인 조직의 특정 발기인/강화, 제어 및 대상 유전자의 녹음 방송 활성 제 바인딩 사이트에 하류 배치 기자/이펙터 라인 항구 transcriptional 활성 제를 표현 합니다. 두 구성 요소를 품고 동물 대상 유전자 발현의 조직-특정 transactivation 유도. 대상된 조직에 유전자의 정확한 spatiotemporal 식 세포/유전자 활동의 편견된 해석에 대 한 중요 하다. 따라서, 독점 세포/조직 관련 드라이버 라인을 생성 하기 위한 방법 개발이 필수적입니다. 여기에 우리가 매우 조직 특정 대상된 식 시스템을 채용 하 여 생성 하는 방법을 제시는 “정기적으로 클러스터 된 Interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 된” (CRISPR/Ca)-게놈 편집 기법을 기반으로. 이 방법에서는, Cas9 공상 두 대상 이다 endonuclease RNAs (gRNA) 더블-스트랜드 나누기 (DSB) 만들려고 초파리 게놈에서 유전자의 첫 번째 코딩 exon에 특정 사이트 안내. 그 후, transactivator 시퀀스를 포함 하는 외 인 기증자 플라스 미드를 사용 하 여 셀 자치 수리 기계 수 있습니다 homology 감독 수리를 (HDR) 정확한 삭제 하 고는 transactivator와는 엑손의 교체 DSB의 시퀀스입니다. 절에서 transactivator 셀에 독점적으로 표현 된다 어디 cis-대체 유전자의 규제 요소가 기능. 여기에 제시 된 초파리 fgf에 표현 하는 이진 transcriptional 드라이버 생성에 대 한 자세한 단계별 프로토콜 /branchless-상피/신경 세포 생산 유전자 또는 조직의 특정 식에 대 한 채택 될 수 있다.
Introduction
타겟된 유전자 발현에 대 한 유전 도구 상자 잘 초파리, 다양 한 세포질 프로세스에서에서 포함 된 유전자의 기능을 조사 하기 위해 최고의 모델 시스템 중 하나에서 개발 되었습니다. 이진 식 시스템, 효 Gal4/UAS (상류 활성화 순서), 초파리 유전자 모델1 (그림 1)에서 조직 관련 증강 트랩 및 유전자 misexpression에 처음 채택 되었다. 이 시스템 기법 유전자 overexpression, misexpression, 선택 된 셀 그룹에 또한 셀 절제, 셀 표시, 세포질이 고 분자의 라이브 추적에서 녹아웃 spatiotemporal 규제 등의 많은 수의 개발을 촉진 배아와 조직, 계보 추적 및 모자이크 분석 개발 하는 동안에 처리 합니다. LexA세균성 같은 이진 전사 시스템의 수 /LexAop 시스템 (그림 1)와 Neurospora Q-시스템, 초파리, 이외에에서 널리 사용 지금 되는 강력한 유전자 도구 타겟된 유전자 식1,2,3에 대 한 원래 Gal4/UAS 체계.
여기, 우리는 게놈 편집 기법을 사용 하 여 신뢰할 수 있는 조직 관련 이진 식 시스템을 생성 하는 방법을 제시. CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술에 있는 최근 전진은 전례 없는 기회를 생물의 광범위 한 범위에서 감독된 게놈 변화를 만들 수 있다. 다른 사용 가능한 게놈 편집 기술에 비해, CRISPR/Cas9 시스템은 저렴 한 효율적이 고 신뢰할 수 있는. 이 기술은 이용 한다 세균성 적응 면역 시스템의 구성 요소: Cas9 endonuclease 만드는 두 배 물가 틈 (DSB), 연쇄 상 구 균 pyogenes 및 공상 가이드 RNA (gRNA)는 Cas9에 대 한 특정 게놈 사이트 안내 타겟된 DSB4. 셀은 DSB 다른 경로 사용 하 여 복구 하는 기계를 포함 합니다. 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 템플릿으로 exogenous HDR 기증자를 사용 하 여 정의 된 감독/바람직한 게놈 노크에서 / 노크-아웃을 소개 하는 homology 감독 수리 (HDR) 동안 유전자 기능을 방해 작은 삽입 또는 삭제를 리드. HDR-기반 대체 전략 전통적인 증강 트랩 메서드의 모든 한계를 극복할 수 있는 매우 신뢰할 수 있는 조직 관련 이진 식 시스템을 생성 하기 위해 효율적으로 활용할 수 있습니다. 우리 초파리의 내 생 transcriptional 및 post-transcriptional 규정의 제어에서 표현 되는 이진 전사 드라이버 라인 생성에 CRISPR/Cas9 기반 HDR 수리의 활용에 대 한 단계별 절차를 설명 유전자. 이 프로토콜에 대 한 특정 드라이버 라인의 세대 설명 branchless (bnl) 유전자 조절 tracheal 기도 상피5분기 morphogenesis FGF 가족 단백질을 인코딩. 이 예제에서 bnl 유전자의 첫 번째 코딩 exon 어떤 생 ci를 변경 하지 않고 세균 LexA transactivator 시퀀스의 순서에 의해 대체 되었다- bnl 유전자의 규제 시퀀스. 우리는 전략 생성 bnl LexA 드라이버 라인 spatiotemporally 독점적으로에서 bnl- LexAoperator (LexAop 또는 LexO)의 다운스트림 배치 취재 원 유전자의 표현을 제어 하는 표시 상피/엽/신경 세포를 표현합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전통적으로, 초파리 증강 트랩은 두 가지 방법으로 생성 되었다. 방법 중 하나는 드라이버의 임의 삽입 포함 (예., Gal4) 이항에 의해 게놈 시퀀스 (예., P 요소 이항)1 . 또는, 게놈3,11의 소성 사이트에 통합 될 것 이라고 하는 플라스 미드 구문에 상 상속 증강/발기인 지역의 transcriptional 통제 드라이버 시퀀스를 배치할 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 박사 F. 포트, 감사 닥터 K. 오 코너-자일 스, 닥터 미 Feng CRISPR 전략;에 대 한 토론에 대 한 박사 결핵 콘 버그, 그리고 시 약; 대 한 블루밍턴 재고 센터 UMD 이미징 핵심 시설; NIH에서 자금: R00HL114867 및 R35GM124878 미스터를
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Biologie moléculaire |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Biologie moléculaire |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Biologie moléculaire |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Biologie moléculaire |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Biologie moléculaire |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Biologie moléculaire |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Biologie moléculaire |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Biologie moléculaire |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Biologie moléculaire |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Biologie moléculaire |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Biologie moléculaire | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Biologie moléculaire |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Biologie moléculaire |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
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