Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas
Summary
Este Protocolo introduce un método de dos pasos simples para diferenciar células epiteliales limbares córneas de células de vástago pluripotent humana bajo condiciones de cultivo libre de xeno – y alimentador. Los métodos de cultivo celular presentados aquí permiten la producción a gran escala, costo-eficiente de células de calidad clínica aplicables al uso de terapia celular corneal.
Abstract
Células madre epiteliales limbares corneales (LESCs) es responsables de renovar continuamente el epitelio corneal y manteniendo así la homeostasis corneal y claridad visual. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-LESCs derivadas proporcionan una fuente prometedora de células para la terapia de reemplazo celular corneal. Indefinido, xenogeneicos condiciones de cultura y diferenciación causan variación en resultados de investigación e impiden la traducción clínica de terapias derivadas de hPSC. Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para la diferenciación de hPSC-centro condiciones xeno – y alimentador sin células. En primer lugar, cultura de monocapa de hPSC indiferenciado recombinante laminin-521 (LN-521) y definido hPSC medio sirve como una base para la producción de robusta de alta calidad material de partida para la diferenciación. En segundo lugar, un método de diferenciación rápida y simple hPSC-centro produce poblaciones de centro en tan sólo 24 días. Este método incluye una inducción ectodérmica superficial de cuatro días de suspensión con moléculas pequeñas, seguido de fase de cultura adherente en matriz de combinación de LN-521/colágeno IV en medio de la diferenciación epitelial corneal definida. Cryostoring y extendida diferenciación además purifica la población celular y permite a Banca de las células en grandes cantidades de productos de terapia celular. Las calidad resultantes hPSC-LESCs ofrecen una potencial estrategia de tratamiento nuevo para la reconstrucción de la superficie corneal tratar límbica (LSCD).
Introduction
La córnea transparente en la superficie ocular permite que la luz entrar en la retina y proporciona la mayoría del poder refractivo del ojo. La capa más externa, el epitelio estratificado córneo, es continuamente regenerada por células epiteliales limbares (LESCs). Las LESCs residen en la capa basal de los nichos limbares en la ensambladura corneoscleral1,2. LESCs carecen de marcadores específicos y únicos, por lo que su identificación requiere un análisis más extenso de un conjunto de marcadores de supuesta. Epiteliales de transcripción factor p63 y sobre todo N-terminal transcripción truncada de la isoforma alfa de p63 (ΔNp63α), se ha propuesto como un relevante positivo centro marcador3,4. División asimétrica de LESCs les permite uno mismo-renovar, pero también producir progenie que migran centripetally y anterior. Como las células progresan hacia la superficie corneal gradualmente pierden su troncalidad y finalmente terminal diferenciarse a células escamosas superficiales que desaparecen continuamente de la superficie corneal.
Daño a ninguna de las capas de la córneas puede conducir a la debilitación visual severa, y defectos córneos son así una de las principales causas de pérdida de la visión en todo el mundo. En límbica (LSCD), el limbo es destruido por la enfermedad o trauma que conduce a conjunctivalization y opacificación de la superficie corneal y pérdida subsecuente de visión5,6. La terapia de reemplazo celular usando injertos limbares autólogos o alogénicos ofrece una estrategia de tratamiento para los pacientes con el LSCD4,7,8,9. Sin embargo, injertos autólogos de cosecha tiene un riesgo de complicaciones en el ojo sano y tejido del donante escasea. Células pluripotenciales humanas (hPSCs), específicamente células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs), puede servir como una fuente ilimitada de tipos células clínicamente relevantes, incluyendo células epiteliales corneales. Por lo tanto, derivado de hPSC LESCs (hPSC-LESCs) representan una atractiva fuente de células nuevas para la terapia de reemplazo celular ocular.
Tradicionalmente, los métodos de cultura hPSC indiferenciados y sus protocolos de diferenciación a LESCs han confiado en el uso de células de alimentador indefinido, sueros animales, media condicionada o membranas amnióticas10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recientemente, esfuerzos hacia productos de terapia celular más seguros han llevado a la búsqueda de más protocolos estandarizados y xeno-libre cultura y diferenciación. Como resultado, varios métodos definidos y xeno-libre para la cultura a largo plazo de hPSCs indiferenciada están ahora disponibles en el mercado16,17,18. Como un continuum, diferenciación dirigida protocolos depender de señales moleculares para hPSCs destino epitelial corneal han sido recientemente introducidos19,20,21,22, 23. Sin embargo muchos de estos protocolos utilizan sea indefinido, hPSCs alimentador basado en como a partir de material, o un cóctel complejo, xenogeneicos factor de crecimiento para la diferenciación.
El propósito de este protocolo es proporcionar un robusto y optimizado, xeno- y método de cultivo libre de alimentador hPSC y posterior diferenciación a LESCs corneales. Cultura de monocapa de hPSCs pluripotentes en 521 laminina (LN-521) matriz en medio de hPSC definida, libre de albúmina (específicamente esenciales 8 Flex) permite la producción rápida de material homogéneo a partir de diferenciaciones. Después de eso una simple estrategia de diferenciación de dos pasos guías hPSCs hacia destino ectodérmica superficial en suspensión, seguida de diferenciación adherente al LESCs. Se obtiene una población de la célula donde > 65% express ΔNp63α dentro de 24 días. El protocolo de xeno-alimentador-libre y ha sido probado con varias líneas de hPSC (hESCs y hiPSCs), sin ningún requisito para optimización específico de línea celular. Los protocolos para fin de semana libre mantenimiento, pases, cryostoring y hPSC-centro phenotyping aquí descritos permiten la producción de grandes lotes de LESCs de alta calidad para clínicas o propósitos de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El resultado esperado de este protocolo es la generación exitosa y sólida de LESCs de una suspensión unicelular de FF hPSC en aproximadamente 3,5 semanas. Como epitelio corneal se desarrolla del ectodermo superficial29, el primer paso del Protocolo tiene como objetivo hPSCs a este linaje de dirección. Una inducción corto 24 h con la transformación del factor de crecimiento beta (TGF-β) antagonista SB-505124 y bFGF se utilizan para inducir la diferenciación ectodérmica, seguida por 48 h me…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por la Academia de Finlandia (número 297886), el programa de recambios humanos de Tekes, la Agencia de financiamiento finlandés para tecnología e innovación, el ojo finlandés y Fundación Banco de tejidos y la Finnish Cultural Foundation. Los autores agradecen a los técnicos de Laboratorio biomédico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt y Outi Heikkilä excelente asistencia técnica y aporte a la cultura de célula. Profesor Katriina Aalto-Setälä es reconocida para proporcionar la línea hiPSC y BioMediTech Imaging Core para suministro de equipos para proyección de imagen de fluorescencia.
Materials
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 ml cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye–a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
- International Stem Cell Initiative, , et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
