. מלחציים צולבים כוח Rheometry על אפיון Hydrogels מבוססי חלבונים
Summary
טכניקה חדשה של rheometry כוח-קלאמפ משמש כדי לחקור את התכונות המכאניות של דגימות בנפח נמוך חלבון מבוססת הידרוג קשורה בין מנוע סליל קול חיישן כוח. מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת מאפשר לבצע את ‘חסימת העורקים’ של הכוח מנוסים בפרוטוקול הרצוי.
Abstract
כאן, אנו מתארים שיטה rheometry כוח-קלאמפ לאפיין את המאפיינים ביו-מכני של חלבון מבוססת hydrogels. שיטה זו משתמשת מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת להחלת פרוטוקולים כוח מבוקר על דגימות הידרוג חלבון מבוססת גלילי, אשר הם קשורה בין מנוע ליניארי קול סליל מתמר כוח. במהלך המבצע, מערכת PID מתאימה ההרחבה של המדגם הידרוג לעקוב פרוטוקול כוח שהוגדרו מראש על-ידי הקטנת ההבדל בין הכוחות נמדד קבע-נקודה. גישה ייחודית זו כדי hydrogels חלבון מבוססת מאפשר קשירה של דגימות הידרוג מאוד מצומצמות (< 5 µL) עם חלבונים שונים ריכוזים. תחת פרוטוקולים כוח-כבש, שבו הלחץ יישומית עליות וירידות באופן ליניארי עם הזמן, המערכת מאפשרת המחקר של ההתנהגויות גמישות ורכות היסטרזיס הקשורים עם קיפול (האו ם) של חלבונים והמידה של אלסטי סטנדרטי, viscoelastic פרמטרים. תחת קבוע-כוח, שם דופק כוח יש צורה כמו שלב, התגובה אלסטי, בשל לשינוי בכוח, הוא decoupled של התגובה viscoelastic, אשר מגיע מהתחום חלבון התגלגלות, refolding. בשל בנפח נמוך מדגם שלה צדדיות בהחלת לפליטת מכניים שונים, rheometry כוח-קלאמפ ממוטבת כדי לחקור את התגובה מכני של חלבונים תחת כוח תוך שימוש בגישה גורפת.
Introduction
פרט מאפיינים הפיזיים ייחודיים, חלבון מבוססת hydrogels להחזיק את ההבטחה של לעשות מהפכה ספקטרוסקופיה בכוח על-ידי הפיכת המדידה של מספר מולקולות מיליארד ב אחד ‘למשוך’, ובכך מאפשר חקר חלבונים בסביבות צפופות, דומה אלה המצויים העור ורקמות אחרות. חלבון תחומים נשארים מקופל בתוך hydrogels, המאפשר חקר את תגובתם biomechanical לכפות, איגוד שותפים והתנאים כימי. בנוסף, התגובה ביו-מכני של חלבון תחומים בתוך hydrogels דומה את התגובה עם טכניקות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת. לדוגמה, denaturants כימי וסוכנים חמצון להקטין את יציבות המדינה מקופל,2,3 ברמה1,תחום חלבון יחיד והן מאקרוסקופית ברמה4,5 , 6 , 7. באופן דומה, osmolytes להגדיל את היציבות של חלבונים יחידה8,9, המוביל לירידה התגובה viscoelastic של hydrogels, עבור אותו לכפות תנאים7,10.
מספר גישות יושמו לסנתז חלבון מבוססת hydrogels, על ידי או באמצעות אינטראקציות גופניות11,12 או קוולנטיות cross-linking4,13. תגובות קוולנטיות לאפשר מיקומים קבועים cross-linking, hydrogels אלה ניתן לשחזר את המצב ההתחלתי על הסרה של לפליטת כימי או מכני. בגישה מוצלח עבור cross-linking קוולנטיות מסתמך על יצירת קישור קוולנטי, קשרי פחמן-פחמן הקשרים בין חומצות האמינו טירוזין חשוף באמצעות קירור (APS) כמו של חמצון ומלח רותניום (II) יוזם (איור 1)14. עם חשיפה לאור לבן, פתרון של חלבונים מרוכזים יכולים להיהפך של הידרוג. על ידי שליטה כאשר הוא מתחיל התגובה, לערבב חלבונים-APS יכול להיות מוזרק בכל צורה הליהוק, כגון טפלון (PFTE) צינורות (איור 1B ו- 1 C), המאפשר שימוש אמצעי אחסון קטן מאוד פתרון15. יתר על כן, השימוש של אור לבן כדי לעורר את התגובה cross-linking תוצאות הלבנת מוגבלת של חלבונים פלורסנט ומאפשר ניסוח של hydrogels ללא הפרדות צבע עם סמנים פלורסנט (איור 1). שיטות אחרות של היווצרות חלבון מבוססת הידרוג להשתמש cross-linking המבוססת על אינטראקציה קוולנטיות SpyTag-SpyCatcher16, אמין cross-linking ויה גלוטראלדהיד13, או אינטראקציות ביוטין-streptavidin17.
ניתוח מכני דינמי (DMA) היא טכניקה המשמשת בהרחבה ללמוד מבוסס פולימר hydrogels13,18. בעוד DMA באפשרותך להחיל כוח קבוע פרוטוקולים biomaterials, זה דורש מודולים של יאנג מעל 10 kPa ואמצעי אחסון מדגם גדולים של יותר מ-200 µL19. בשל מגבלות אלו, חלבון hydrogels הם בדרך כלל יותר מדי רכים להיחקר על ידי שיטה זו. Polyproteins הנדסה קשים יותר לסנתז מאשר פולימרים, מכיוון שהם דורשים מערכת חיה כדי לייצר, שאמצעי אחסון גבוהה אלה הם יעיל,4,הטוב ביותר15. יתר על כן, רוב רקמות ביולוגיות, רכים יותר 10 kPa. מספר גישות פותחו עבור דגימות ביולוגיות, במיוחד במחקר של שריר אלסטיות20,21. טכניקות אלה יכולים לפעול גם תחת משוב להפעיל כוח קבוע אבל הממוטבות דגימות עם צווארונים קטנים אטומים מפליז (בטווח מיקרון) חשופים לכפות לזמנים קצרים מאוד (בדרך כלל פחות מ- 1 s).
Hydrogels חלבון מבוססת נחקרו בהצלחה עם טכניקות rheometry שונה. לדוגמה, השלכת את הידרוג בצורת הטבעת מאפשרת את השימוש rheometry הארכת כדי למדוד את השינוי בחיל מנוסים כפונקציה של סיומת4,22. גישות אחרות ללמוד את מאפייני rheological מבוססי חלבונים hydrogels שימוש מבוקר מאמץ גזירה-rheometry. שיטות אלה ניתן גם להשיג נפח דגימה נמוכים, לסבול חומרים רכים. עם זאת, אלה שיטות חוסר היכולת לחקות את משיכת כוחות כי הסיבה חלבון התגלגלות ויוו, מודול האלסטיות הוא מחושב בהתבסס על תיאוריות מורכבות הדורשות הנחות והתיקונים השונים23.
לאחרונה דיווחנו גישה חדשה אשר מנצל נפח קטן של חלבונים, polymerized בתוך צינורות עם קטרים < 1 מ מ. היישום הראשון שלנו של טכניקה זו היה פועל במצב אורך-קלאמפ, שבו הג'ל הוארך בעקבות הרצוי פרוטוקול ה-15. בשיטה זו, החלבונים לחוות שינוי רציף סיומת והן כוח בזמן התחומים מתגלגלים, שהופך את פרשנות הנתונים מסורבלת. לאחרונה, אנו מדווחים על טכניקה rheometry כוח-קלאמפ חדשה, שבו לולאת משוב יכול לחשוף בנפח נמוך חלבון hydrogels על פרוטוקול כוח מראש7 (איור 2). מערכת PID אנלוגי משווה את כוח נמדד על ידי חיישן כוח עם הנקודה סט הנשלחים מהמחשב ומתאים את הסיומת ג’ל על-ידי הזזת את הגליל קול כדי למזער את ההבדל בין שתי כניסות. זה ‘מחבר חובק למעקה’ של הכוח מאפשר כעת סוגים חדשים של ניסויים כדי למדוד את ביומכניקה של חלבון hydrogels.
במצב כוח-כבש, חוויות הידרוג חלבון עגינה על עליה מתמדת וירידה בכוח עם הזמן. ה-PID מפצה על כל דפורמציה viscoelastic על ידי שינוי הסיומת באופן ליניארי, בהתאם לסוג של חלבון ו הידרוג ניסוח. היתרון העיקרי של כוח הרמפה הוא שהיא מאפשרת כימות של פרמטרים סטנדרטיים, כגון מודול האלסטיות, פיזור אנרגיה, בשל התגלגלות של refolding של חלבון תחומים.
במצב קבוע-כוח, הכוח שהוחל משתנה אופנה כמו שלב. במצב זה, הג’ל מרחיב חוזים elastically כאשר הכוח או ההגברה, בהתאמה, ואחריו עיוות תלויי-זמן. דפורמציה viscoelastic הזה, המתרחשים בזמן הג’ל חוויות כוח קבוע, קשור ישירות לתחום התגלגלות/refolding. בצורה פשוטה, הרחבה זו ניתן לראות המקבילה של מספר עקבות מולקולה בודדת מיליארד בממוצע יחד ומדדתי את הכל בבת אחת. פרוטוקולים קבוע-כוח ניתן ללמוד על השרץ ורגיעה של חלבון hydrogels כפונקציה של כוח וזמן. כפונקציה של כוח, למען hydrogels חלבון מבוסס-BSA, לאחרונה הראינו שיש תלות לינארית בין סיומת אלסטי, viscoelastic ובצינתם עם זן יישומית7.
כאן אנחנו פירוט המבצע של rheometer כוח-קלאמפ באמצעות ג’ל ללא הפרדות צבע עשוי תערובת של חלבון L (8 תחומים24, ו”כדור L8) וגם מבנה החלבון L-eGFP (L-eGFP), מה שהופך את הידרוג הכוללת פלורסנט וקל להפגין.
Protocol
Representative Results
Discussion
במסמך זה, אנו מתארים שיטה rheometry כוח-קלאמפ לחקור את התגובה ביו-מכני של hydrogels חלבון מבוססת בנפח נמוך. בנוסף, פרוטוקול מסופק לסנתז מדגם הידרוג חלבון בנפח נמוך גלילי אחיד. פרוטוקול מוצג גם המתאר איך לקשור סוגים שונים של חלבון מבוססת hydrogels עם elasticities שונים מבלי לגרום לכל דפורמציה מכאנית או נזק דגי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר תמיכה כספית מן המחקר צמיחה יוזמה (פרס מס 101 X 340), הקרן הלאומית למדע, מחקר מכשור חוגי (מענק מס ‘ PHY-1626450), מילווקי גדול קרן (זוכה פרס שאו) ומערכת של אוניברסיטת ויסקונסין (מחקר יישומי גרנט).
Materials
| SI-KG4A force transducer | World Precision Instruments (WPI) | SI-KG4A | |
| Linear Voice Coil Motor | Equipement Solutions | LFA2010 | |
| Bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals (RMBIO) | BSA-AAF-1XG / 100 G | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 248614-100G | |
| Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride | Sigma-Aldrich | 544981-1G | |
| EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON SUTURE 12/PK | Fisher Scientific | NC0395626 | |
| 1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| Silane, Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | |
| Hypodermic Needle, 23 Gauge | Healthcare Supply Pros | 305194 | |
| Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips – 24 gauge | KIMCO | JG24-1.5X | |
| USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp | ALB | USH-103D USHIO | |
| Medical Tweezers | |||
| Medical scissors | |||
| Olympus | |||
| The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author. |
References
- Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?. Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
- Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
- Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
- Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
- Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
- Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
- Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
- Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
- Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
- Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
- Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370 (2016).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
- Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
- Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
- Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chimie. 21 (8), 3178-3182 (2015).
- Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
- Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
- Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
- McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
- Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
- Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
- Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).
- Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
- Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).
